焦虑症生物标记物、筛选方法及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及焦虑症生物标记物、筛选方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 广泛焦虑障碍（GAD)是一种以对许多事件或情境过分的和不可控制的担忧为特 征的慢性疾病，同时伴有躯体症状，例如坐立不安，肌紧张，易激惹，注意集中困难和睡眠障 碍等。GAD在普通人群中的年患病率为0.8-2. 7%，已成为主要的公众健康问题。此外， GAD通常还伴有其他精神障碍（如：抑郁、其他焦虑障碍等）和躯体疾病（如：心血管疾病、 神经系统疾病等）。50%的焦虑症患者合并其它精神障碍，例如抑郁。
[0003] 已有研宄表明，焦虑症病人若能早期明确诊断并及时得到有效治疗，可以显著改 善患者的心理、生理、社会功能以及工作效率，并大大减少治疗费用。然而，目前对焦虑症的 诊断仍是依靠其临床症状的主观评估，缺乏有效的客观诊断"金标准"，因而在临床上误诊、 误治时有发生。另一方面，由于事先未知患者对哪种药物敏感，临床上不得不用"试错法"给 药，这不仅影响患者的治疗效果，而且降低其服药依从性，并造成巨大的资源浪费。因此，有 必要研发一种具有敏感性和特异性的生物标志物，来提高焦虑症的诊断科学性，并对其亚 型加以区分，以便于有针对性地进行药物干预和开展临床科学研宄。
[0004]miRNA是一种小分子的非编码RNA，长度为大约为22个碱基。miRNA的生成包括 两步剪切：首先细胞核内的miRNA基因转录成pri-miRNA，由细胞核内的酶DroshaRNase将 其剪切成miRNA前体pre-miRNA。核内的转运蛋白将pre-miRNA转运到细胞质中，然后在细 胞质中的另一种酶Dicer把miRNA前体剪切成双链miRNA，通过部分或完全地与靶mRNA的 3'非翻译区（3'UTR)互补配对，阻止其翻译或使其降解，从而起到基因转录后调节的作用。 约有50%的蛋白质编码基因受到miRNA的精确调控，多个miRNA分子可以共同调节一个基 因的表达，一个miRNA分子亦可调控数百、上千个基因的表达。越来越多的研宄证明，在大 脑的发育、神经发生、神经元成熟及突触形成过程中，miRNA起关键的调控作用。进一步的 研宄表明，焦虑症的发生、发展中，miRNA亦起重要作用，并与抗焦虑药物的疗效有相关性。 因此，某些MicroRNA可成为焦虑症诊断和预测抗焦虑药物治疗效果的生物标记物。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是：提供焦虑症生物标记物。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：焦虑症生物标记物，所述标记 物包括miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-4674、miRNA-501-3p、miRNA-663B和miRNA-4505。
[0007] 在本发明的第二方面，提供了上述焦虑症生物标记物的筛选方法，包括以下步骤： 取适量受试者血液，从中提取总RNA，并检测提取到的总RNA浓度；通过miRNA芯片筛查出 差异性表达的7种miRNA;选取若干例焦虑症患者，设为病例组；选取若干例健康对照者，设 为对照组；分别采集血样，提取出单核淋巴细胞中的总RNA后进行miRNA的反转录和荧光 定量PCR检测，所得数据使用统计学方法进行分析，得到两组间表达水平有显著性差异的 miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-4674、miRNA-501-3p、miRNA-663B和miRNA-4505。
[0008] 在本发明的第三方面，提供了一种焦虑症诊断试剂盒，其能够测定血液中 miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-4674、miRNA-501-3p、miRNA-663B和miRNA-4505 的表达水 平。
[0009] 在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有miRNA-1301、miRNA-4484、 miRNA-4674、miRNA-501-3p、miRNA-663B和miRNA-4505 的引物探针。
[0010] 在本发明的一个优选例中，上述引物探针的序列如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 和SEQIDNO. 6 所示。
[0011] 所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液， dNTPs，MgCljPDEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0012] 在本发明的一个优选例中，提供了序列如SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 2、SEQID NO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6所示引物探针的用途，其用于制备焦虑症 诊断试剂盒。
[0013] 在本发明的第四方面，提供了一种预测抗焦虑药物疗效的生物标记物，所述标记 物包括miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-663B和miRNA-4505。
[0014] 在本发明的第五方面，提供了上述预测抗焦虑症药物疗效生物标记物的筛选方 法，包括以下步骤：取适量受试者血液，从中提取总RNA，并检测提取到的总RNA浓度；通过miRNA芯片筛查出差异性表达的miRNA;选取若干例焦虑症患者进行临床药物干预随访观 察，对选取得到的患者分别施以临床常用的抗焦虑药，在用药前和用药六周后分别采集血 样，提取出单核淋巴细胞中的总RNA后进行miRNA的反转录和荧光定量PCR检测，所得数据 使用统计学方法进行分析，得到用药前后表达水平有显著性差异的miRNA。
[0015] 在本发明的第六方面，提供了一种预测抗焦虑症药物疗效的生物标记物检测试剂 盒，其能够测定血液中miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-663B和miRNA-4505的表达水平。
[0016]在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有miRNA-1301、miRNA-4484、 miRNA-663B和miRNA-4505 的引物探针。
[0017] 在本发明的一个优选例中，上述引物探针的序列如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQ IDNO. 5 和SEQIDNO. 6 所示。
[0018] 所述试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs， MgClJPDEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0019] 在本发明的一个优选例中，提供了序列如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDN0. 5 和SEQIDNO. 6所示引物探针的用途，其用于制备预测抗焦虑症药物疗效的试剂盒。
[0020] 本发明的有益效果在于：
[0021] 1、焦虑症的诊断将不再只是主观经验判断，而是可以通过microRNA这种客观指 标检查，进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程；
[0022] 2、有望通过miRNA模拟物和拮抗物（修饰寡核苷酸）改变特定miRNA表达水平能 够使异常的基因调控网络和信号通路正常化，进而治疗焦虑症；
[0023] 3、有望通过检测特定miRNA表达水平对焦虑症的用药疗效进行预测；
[0024] 4、有望通过检测特定miRNA表达水平对焦虑症患者转归及预后情况进行预测；
[0025] 5、有望通过miRNA模拟物和拮抗物对特定焦虑症某种特定症状进行针对性治疗。
【附图说明】
[0026] 图1为焦虑症与抑郁症患者miRNA_26b的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0027] 一、研宄对象
[0028] 1.病例组：2012年8月至2014年6月于中国人民解放军第102医院门诊以及精神 科病房连续收治的病人。入组标准：①符合美国精神疾病诊断和统计手册第4版（DSM-IV) GAD标准；②首发病人或入组前3个月未服抗焦虑药物；③年龄15~80岁。排除标准：① 患有其他精神疾病；②患有脑外伤等躯体或神经系统疾病；③有酗酒或药物滥用史；④入 组前1个月内有输血史；⑤入组前3个月内使用过无抽搐电休克治疗者（MECT)。共入组76 例患者，其中男性19例，女性57例。
[0029] 2.对照组：来自解放军第102医院工作人员、健康体检人员，除一例性别不匹配 外，其余与病例组年龄、性别和民族一一匹配，最大限度排除了性别、年龄和民族等因素带 来的误差。纳入标准：①无精神疾病家族史；②近1个月内无重大创伤事件；③近1月内无 输血史。共入组39例，其中男性10例，女性29例。
[0030] 在开展研宄前，首先对参加本课题的精神专科医师和研宄生进行培训。采用汉密 顿焦虑量表（HAMA)、大体评定量表（GAS)在病例入组前、药物治疗3周后、药物治疗6周后 分别进行评估。由两位精神科主治医师根据DSM-IV-TR对患者进行诊断，如果出现不一致 情况，则请一位精神科主任医师共同讨论后确定诊断。
[0031] 入组时记录一般情况（姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状 况、药物成瘾史及精神疾病家族史等）。同样，记录正常对照组一般情况。
[0032] 本研宄获得中国人民解放军第102医院医学伦理委员会批准，所有受试者或受试 家属（监护人）均签署知情同意书。。
[0033] 二、研宄方法
[0034] ①使用量表
[0035] 汉密顿焦虑量表（HAMA):由Hamilton于1959年编制，是目前最经典的焦虑量表， 能够很好地衡定治疗效果，现已在临床和研宄中广泛应用。该量表主要用于评定神经症及 其他病人焦虑症状的严重程度，共有14个条目，分为5级评分（0~4分），能够较好地反映 病情严重程度。本研宄中使用HAMA量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析， 达到心理测量学标准。本文使用HAMA总分进行统计分析。
[0036] 大体评定量表（GAS):大体评定量表是评价各类精神疾病症状的量表，在同类量 表中是应用最广泛的一种。本研宄使用的是美国心理卫生研宄所（NMH) 1976年的Spitzer 版本，共有10级评定分（1~10分），根据患者临床症状进行评定。总分越高，说明病情越 轻。本研宄中使用GAS量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量 学标准。
[0037] 临床疗效总评量表（CGI):临床疗效总评量表由WHO设计，用于国际精神疾病试点 调查（IPSS)的研宄，现用以评定临床疗效，适用于任何精神科治疗和研宄对象。量表分为 病情严重程度（severityofillness，SI)，疗效总评（globalimprovement，GI)和疗效指 数（efficacyindex，EI)三个分量表。本研宄中使用CGI量表的中文版本进行评估，该版 本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。本研宄中使用疾病严重程度分（severityof illness，SI)和疗效总评分（globalimprovement，GI)进行统计分析。
[0038] ②资料收集
[0039] 入组时记录一般情况（姓名、性别、年龄、民族、文化程度、职业、收入水平、婚姻状 况、药物成瘾史及精神疾病家族史等）。由3名精神科主治医师或医师使用汉密顿焦虑量表 (HAMA)和临床疗效总评量表（CGI)于用药前及用药6周以上对病例组被试进行评定。评定 前，所有参与研宄人员进行统一培训，统一方法等，标准化施测过程。其中HAMD使用总分和 因子分统计，CGI使用疗效总评分（globalimprovement,GI)统计。
[0040] ③药物干预
[0041] 在76例病例中，随机选取11例进行临床药物干预随访观察。对其采用每日服用 文拉法辛（剂量范围150mg-225mg)、舍曲林（剂量范围50m