表皮生长因子受体激酶结构域中的新型突变的利记博彩app
【专利说明】表皮生长因子受体激酶结构域中的新型突变 发明领域
[0001] 本发明涉及用于癌症疗法的癌症诊断和伴随诊断。特别地，本发明涉及突变检测， 所述突变可用于诊断和预后以及预测癌症治疗的有效性。
[0002] 发明背景 表皮生长因子受体（EGFR)也称为HERl或ErbBl，是生长因子受体的1型酪氨酸激酶家 族的成员。这些膜结合蛋白质具有细胞内酪氨酸激酶结构域，其与多种信号传导途径相互 作用。在配体结合后，在该家族中的受体经历酪氨酸激酶结构域的二聚化和后续自磷酸化。 自磷酸化触发细胞内信号传导途径，包括Ras/MAPK、PI3K和AKT途径中的事件级联。通过 这些途径，HER家族蛋白质调节细胞增殖、分化和存活。
[0003] 许多人恶性肿瘤与EGFR的异常表达或功能相关（Mendelsohn等人，（2000) " Se EGF receptor family as targets /hr caflceT iAeTa/y% Oncogene，19:6550-6565. )〇 特 别地，已证实一些癌症具有在EGFR激酶结构域(外显子18-21)中的突变。在非小细胞肺 癌（NSCLC)中，这些突变显示促进恶性细胞中的抗细胞凋亡途径（Pao等人（2004) 〃你 F receptor gene mutations are common in lung cancers from ^never smokers^ and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib"HU. 101 等 XSiWA、" Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti~apoptotic pathways^,Science 305 (5687) 1163 - 1167.)。
[0004] 靶向EGFR的疗法已得到开发。例如，西妥昔单抗（ERBITUX ?)和帕木单抗 (VECTIBIX?)是抗EGFR抗体。厄洛替尼（TARCEVAtm)和吉非替尼（IRESSA tm)是可用作EGFR 酪氨酸激酶的经口活性选择性抑制剂的喹唑啉。这些药物在其癌症由异常EGFR活性驱使 的患者中是最有效的。IRESSA?的随机化的大规模双盲研宄（IRESSA泛亚洲研宄（IPASS)) 比较在非小细胞肺癌（NSCLC)中作为第一线治疗的吉非替尼与常规化学疗法（Mok等人 (2009)aGefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. Eng JMed 361:947-957)。IPASS研宄了具有经证实的腺癌组织学的1,217个患者。该研宄揭 示在具有EGFR突变阳性肿瘤的患者中，无进展存活（PFS)对于IRESSA?显著长于化学疗法。 对于其中EGFR未突变的肿瘤则相反。PFS对于化学疗法显著长于IRESSA TM。该研宄证实为 了改善肺癌患者成功治疗的机会，EGFR突变状态必须是已知的。
[0005] 临床结果的分析揭示具有在EGFR的激酶结构域(外显子18-21)中含有突变的肿 瘤的患者对于厄洛替尼具有的应答优于具有表达野生型EGFR的肿瘤的那些(美国专利号 7, 294, 468和7, 960, 118)。这些突变预测对酪氨酸激酶抑制剂（TKI)，例如喹唑啉厄洛替尼 (TARCEVAtm)和吉非替尼（IRESSA?)的应答。在EGFR突变中，在外显子19的区域中的核苷 酸包括核苷酸2235-2257 (对应于氨基酸746-753)的框内缺失和置换在肺癌患者中是尤 其常见的（参见美国专利号7,294,468 和1^11(311等人（2004)"4<^/^3〇'/71§'5?/(<3以〇/75·//? the epidermal growth factor underlying responsiveness of nonsmall cell lung cancer ?ο职" NEJM 350:2129.)。这些突变被认为导致具有改变特性的活性激 酶，包括对抑制的敏感性增加(参见Paez等人（2004)/???皿i/? /?/?# caflcer/ correlation with clinical response to Gefitinib therapy, Science 304:1497)。 [0006] 在EGFR激酶结构域中的一些突变是常见的，而其他突变更不频繁地发生。然而， 靶向尽可能多的突变的EGFR突变临床测试是必需的。这将确保具有罕见突变的患者未接 受"假阴性"测试结果。如果罕见突变未检测到，则具有此类突变的患者将不会接受潜在的 挽救生命的治疗。因此，当发现EGFR激酶结构域中的新突变时，检测该突变具有影响一些 患者中的临床结果的潜力。
[0007] 发明概述 在一个实施方案中，本发明是经分离的寡核苷酸，其与SEQ ID NO: 1中含有突变 2240_2264>CGAAAGA或2252_2277>GAGAAGCC的核酸特异性杂交。在该实施方案的变化中， 寡核苷酸包含与天然序列不匹配的至少一个核苷酸。在该实施方案的进一步变化中，寡核 苷酸与选自SEQ ID NO: 6-8和9-12的序列至少90%相同。在该实施方案的进一步变化中， 寡核苷酸由选自SEQ ID NO: 6-8和9-12的序列组成。在该实施方案的进一步变化中，寡 核苷酸能够引发在SEQ ID NO: 1中含有突变2240_2264>CGAAAGA的核酸而不是非突变型 SEQ ID NO: 1的选择性扩增。在该实施方案的进一步变化中，寡核苷酸能够引发在SEQ ID N0:1中含有突变 2252_2277>GAGAAGCC的核酸而不是非突变型SEQIDN0:1的选择性扩 增。
[0008] 在另一个实施方案中，本发明是治疗具有肿瘤的患者的方法，所述肿瘤可能具 有在表皮生长因子受体（EGFR)基因中含突变的细胞，所述方法包括：就突变的EGFR基 因的存在测试患者的样品，所述突变的EGFR基因的特征在于SEQ ID NO: 1中的突变 2240_2264>CGAAAGA或2252_2277>GAGAAGCC ;和如果存在突变之一，则给患者施用酪氨酸 激酶抑制剂化合物。在该实施方案的变化中，化合物是西妥昔单抗、帕木单抗、厄洛替尼或 吉非替尼。在该实施方案的进一步变化中，测试使用与选自SEQ ID NO: 6-8和9-12的序 列至少90%相同的寡核苷酸执行。在该实施方案的另一个变化中，该方法进一步包括就突 变的EGFR基因的存在测试患者的样品，所述突变的EGFR基因的特征在于下述突变中的 一个或多个：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、 A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、 L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、 L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、 M766-A767 del Al ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、 L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、 2239_2240 TT>CC、2264 OA 和 E746-A750 del AP ins;并且在步骤（b)中，如果存在突变 中的任一个，则给患者施用酪氨酸激酶抑制剂化合物。
[0009] 在另一个实施方案中，本发明是确定癌症患者对酪氨酸激酶抑制剂疗法的应 答可能性的方法，其包括：就患者样品中的EGFR基因中的突变2240_2264>CGAAAGA或 2252_2277>GAGAAGCC测试患者的样品，并且如果存在突变，则确定患者可能响应酪氨酸激 酶抑制剂疗法。在该实施方案的变化中，酪氨酸激酶抑制剂疗法包含西妥昔单抗、帕木单 抗、厄洛替尼或吉非替尼。在该实施方案的进一步变化中，测试使用与选自SEQ ID NO: 6-8 和9-12的序列至少90%相同的寡核苷酸执行。在该实施方案的进一步变化中，该方法进一 步包括就EGFR基因中下述突变中的一个或多个测试患者的样品：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、 L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、M766-A767 del Al ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、 2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、2239_2240 TT>CC、2264 C>A 和 E746-A750 del AP ins ;并且在步骤（b)中，如果突变中的任一个报告为存在，则确定患者可能响应酪氨酸激 酶抑制剂疗法。
[0010] 在另一个实施方案中，本发明是用于检测人EGFR基因中的突变 2240_2264>CGAAAGA 或 2252_2277>GAGAAGCC 的试剂盒，其包含与 SEQ ID NO: 1 中的突变 2240_2264>CGAAAGA 或 2252_2277>GAGAAGCC 而不是非突变的 SEQ ID NO: 1 特异性杂交 的一种或多种寡核苷酸。在该实施方案的变化中，试剂盒包含与选自SEQ ID NO: 6-8和 9-12的序列至少90%相同的寡核苷酸。在该实施方案的进一步变化中，试剂盒包含核酸前 体、核酸聚合酶以及支持核酸聚合酶活性必需的试剂和溶液。在该实施方案的进一步变化 中，试剂盒包含一种或多种寡核苷酸，其与SEQ ID NO: 1中的下述突变而不是非突变的SEQ ID NO: 1 特异性杂交：G719A、G719C、K745-A750 del K ins、E746V、E746K、L747S、E749Q、 A750P、A755V、S768I、L858P、L858R、E746-R748 del、E746-S752 del V ins、L747-E749 del、L747-A750 del P ins、L747-T751 del、L747-T751 del P ins、L747-P753 del S ins、 L747-S752 del、R748-P753 del、T751-I759 del T ins、S752-I759 del、P753-K757 del、 M766-A767 del Al ins、S768-V769 del SVA ins、G779S、P848L、G857V、L858R、L861Q、 L883S、D896Y、2236_2248>ACCC、2237_2244>CGCCC、2252_2277>AC、2240-2264>CGAAAGA、 2239_2240 TT>CC、2264 OA 和 E746-A750 del AP ins。 toon] 在另一个实施方案中，本发明涉及治疗具有肿瘤的患者的方法，所述肿瘤可能 具有在表皮生长因子受体（EGFR)基因中含突变的细胞，所述方法包括：就突变的EGFR 基因的存在测试患者的样品，所述突变的EGFR基因的特征在于SEQ ID NO: 1中的突变 2240_2264>CGAAAGA或2252_2277>GAGAAGCC ;和如果检测到突变，则给患者施用酪氨酸激 酶抑制剂化合物。在该实施方案的变化中，化合物是西妥昔单抗、帕木单抗、厄洛替尼或吉 非替尼。在该实施方案的进一步变化中，测试使用与选自SEQ ID NO: 6-8和9-12的序列 至少90%相同的寡核苷酸执行。在该实施方案的另一个变化中，该方法进一步包括就突变 的EGFR基因的存在测试患者的样品，所述突变的EGFR基因的特征在于下述突变中的一个 或多个 ：67