一种大豆环氧化合物水解酶制剂及固定化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于材料的技术领域，涉及一种大豆环氧化合物水解酶固定方法及酶制剂。
【背景技术】
[0002]金属有机骨架材料固定化酶是国内外的研宄热点因为其独特多样的拓扑结构、孔隙度以及物理特性。金属有机骨架材料具有多孔、大比表面积和多金属位点等诸多性能，在气体贮存、分子分离、催化、药物缓释等领域有较好的应用前景。
[0003]目前金属有机骨架材料固定化酶常用的是封装和物理吸附的方法将酶固定在中孔载体上，但封装和物理吸附法所需要的固定时间较长(50h，Lykourinou V., ChenY., Wang X.-S., et al.1mmobilizat1n of MP-1I into a mesoporous metal - organicframework, MP-1IimesoMOF: a new platform for enzymatic catalysis[J].Journal ofthe American Chemical Society, 2011，133:10382-10385)，载酶量较低(7.0-50.5mg酶/g 载体，Chen Y., Lykourinou V., Vetromile C., et al.How can proteins enterthe inter1r of a MOF Investigat1n of cytochrome c translocat1n into a MOFconsisting of mesoporous cages with microporous windows[J].Journal of theAmerican Chemical Society, 2012，134:13188-13191)。
【发明内容】
[0004]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简单的沉淀交联技术的固定化方法即一种大豆环氧化合物水解酶固定方法。本发明将酶沉淀在Ui0-66-NH2纳米晶体的表面，再通过戊二醛(交联剂)的交联作用，酶包裹在Ui0-66-NH2m米晶体的表面，从而形成一种特定结构的固定化酶。通过本发明的固定化方法所制备的固定化大豆环氧化合物水解酶具有固定化效率高、酶的稳定性好、载酶量高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。
[0005]本发明的另一目的在于提供由上述固定方法制备而成的酶制剂。
[0006]一种大豆环氧化合物水解酶固定方法，具体包括以下步骤:
[0007](I)将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为5-9的缓冲溶液中，配置成酶溶液；
[0008](2)将(I)中所得的酶溶液与Ui0-66-NH2纳米晶体混合，得到混合物；
[0009](3)在0_35°C下，向⑵所得的混合物中加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终饱和度为80%搅拌混合l_60min，得到混合悬浊液；
[0010](4)将(3)所得的混合悬浊液与戊二醛溶液混合，搅拌l_200min，得到固定化大豆环氧化合物水解酶；
[0011](5)将(4)中所得的固定化大豆环氧化合物水解酶冷冻干燥后得到大豆环氧化合物水解酶制剂。
[0012]所述步骤(I)中的Ui0-66_NH2纳米晶体是由四氯化铬与2_氨基对苯二甲酸合成得到；其具体制备方法为:称取摩尔比为1:1的2-胺基对苯二甲酸(1.1464g)和四氯化锆(1.4914g)溶解到90-1001^的队^二甲基甲酰胺(DMF)中，在80°C的油浴条件下搅拌反应2h，然后调高温度至100°C继续搅拌反应4h ;反应结束后抽滤并用无水乙醇洗涤，最后在70°C条件下烘干即得U1-66-NH2纳米晶体。
[0013]所述缓冲液为磷酸缓冲液；所述酶溶液的浓度为5mg/mL。
[0014]所述戊二醛用量为大豆环氧化合物水解酶与戊二醛的质量比1: (10-20)。
[0015]所述戊二醛溶液的质量浓度为25%。
[0016]所述大豆环氧化合物水解酶与U1-66-NH2m米晶体(即基材)的质量比为1:(2-20)。
[0017]所述步骤(3)、(4)中搅拌速率为100-500r/min。
[0018]所述步骤(2)中大豆环氧化合物水解酶为大豆环氧化合物水解酶酶粉。
[0019]本发明原理:
[0020]U1-66_NH2m米晶体表面含有游离的氨基，而大豆环氧化合物水解酶中的碱性氨基酸(赖氨酸(Lys))含有两个以上的氨基。在溶液中酶蛋白沉降在U1-66-NH2纳米晶体表面，酶中未参与反应的氨基与U1-66-NH2纳米晶体表面的游离氨基、酶自身的氨基在戊二醛的作用下发生交联反应，形成酶蛋白包裹在U1-66-NH2纳米晶体表面的酶-U1-66-NH2纳米晶体复合物，从而实现酶的固定化。酶交联固定于基材(即U1-66-NH2m米晶体)表面的示意图如图6所示。
[0021]相对于现有技术，本发明具有以下优点:
[0022](I)发明使用简单的沉淀交联技术，成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活(60%?99% )，提高载体的载酶量，提高酶活回收率，固定化效果好。
[0023](2)本发明的固定化大豆环氧化合物水解酶方法，能够用于大豆环氧化合物水解酶等一系列含赖氨酸的酶，并具有作为1，2-环氧辛烷不对称高效水解的平台的潜质。
【附图说明】
[0024]图1为交联剂(戊二醛)的用量对酶制剂的相对酶活回收率以及载酶量的影响；
[0025]图2为交联时间对酶制剂的相对酶活回收率以及载酶量的影响；
[0026]图3为基材(即U1-66_NH2m米晶体)与酶的质量比对酶制剂的相对酶活回收率以及载酶量的影响；
[0027]图4为实施例1制备的酶制剂在不同pH之下的相对酶活力；
[0028]图5为实施例1制备的酶制剂在不同温度下的相对酶活力；
[0029]图6为酶交联固定于基材(即U1-66-NH2m米晶体)表面的示意图。
【具体实施方式】
[0030]下面结合实施例以及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0031]实施例1
[0032]将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为6.5的磷酸缓冲溶液中，配置成酶溶液；将50mg仍0-66-順2纳米晶体(基材)与ImL 5mg/mL的酶溶液混匀(质量比10:1) ;0°C搅拌下加入一定体积的饱和硫酸钱溶液(饱和度为100% )，使硫酸钱的最终饱和度为80%，以200rpm的搅拌速度搅拌30min ;加入一定量25 %的戊二醛溶液，使戊二醛终质量为65mg，在0°C、300rpm下搅拌交联反应120min Γ冼涤、冷冻干燥得到大豆环氧化合物水解酶制剂I。
[0033]酶制剂I的相对酶活回收率为82.911%，产品中大豆环氧化合物水解酶与U1-66-NH2基材比例为89.56mg/g。对酶制剂I进行酶活性的测试，测试结果如图4、5所不O
[0034]只改变戊二醛的用量，其他条件与实施例1相同，分别得到以下酶制剂:戊二醛终质量为57.5mg，得到酶制剂2 ;戊二醛终质量为62.5mg，得到酶制剂3 ;戊二醛终质量为70mg，得到酶制剂4 ;戊二醛终质量为75mg，得到酶制剂5 ;戊二醛终质量为88.4mg，得到酶制剂6。测定酶制剂(酶制剂1-6)的相对酶活回收率和载酶量，其测试结果如图1所示，图1为戊二醛的用量对酶制剂的相对酶活回收率和载酶量的影响。