一株产β-葡萄糖苷酶的植物内生真菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及从天南星科(Araceae)年复鳳? PinelIiaTenore)植物植株中分离筛选出一株高产β -葡萄糖苷酶的内生真菌及其应用。
【背景技术】
[0002]0-葡萄糖苷酶(01111(:0&(1&%403.2.1.21)，又称β _D_葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，它也是纤维素酶复合酶系发挥协同作用的关键酶。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现，后来的研宄发现，β -葡萄糖苷酶存在于自然界中许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉和细菌体内。它参与生物体的糖酵解，对维持生物体正常生理功能起着重要的作用。
[0003]葡萄糖苷酶是纤维素酶的一个重要组成部分，在医疗、食品、生物质转化中有重要的应用价值，它将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质。近年来国内对葡萄糖苷酶的研宄已经成为热点，已由过去的研宄从大豆、蚕豆、茶叶、香菇、微生物等材料中简单提取葡萄糖苷酶到现在微生物的培养条件优化、酶基因的克隆以及粗酶液的纯化。葡萄糖苷酶基因的克隆表达已经得到实现，新构建的工程菌已经应用到生产实践中，国内已有利用葡萄糖苷酶工程菌制备葡萄糖苷酶的报道，但工艺复杂、生产成本过高严重制约了其产业化发展。所以筛选、鉴定、培养高产葡萄糖苷酶微生物，并从培养基或微生物中提取葡萄糖苷酶依然是目前解决葡萄糖苷酶来源的主要途径。
[0004]栀子蓝色素是以栀子苷为原料，采用生物技术制得的一种安全无毒的食用天然色素，我国于1999年在制定新增食品添加剂的使用卫生标准时已将其列入其中。目前，栀子蓝色素的制备主要有微生物发酵法和β -葡萄糖苷酶水解转化法。专利CN101016421A和专利CN102559796A分别用黑曲霉和酵母菌发酵制备栀子蓝，但这两种微生物对栀子苷的生物转化率较低，使得制备的栀子蓝色素色价不高。专利CN102021202A、CN102732050A、CN201310504179.X采用市售的纤维素酶、果胶酶和β -葡萄糖苷酶，其水解专一性较差或活力较低，使栀子苷转化率和所产栀子蓝色素色价都较低。
【发明内容】
[0005]1、菌种筛选:
取新鲜天南星科(Araceae)年夏麗? PinelIia Tfeflore)植物植株，用无菌水冲洗干净，切成0.5cmX0.5cm的小块，经过紫外消毒，75%乙醇消毒lmin，2.5%次氯酸钠消毒lOmin，再用75%乙醇消毒lmin，无菌水冲洗2?3次，接入已倒好的PDA固体平板培养基上。将培养皿置于28°C培养箱中倒置培养3?7天。待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化得到3株植物内生真菌分别命名为ZZG-1、ZZG-2、ZZGUf他们分别添加到含β-葡萄糖苷酶水解底物的培养基中培养，该培养基中:β-葡萄糖苷酶水解底物为栀子苷、水杨苷、大豆异黄酮中的一种，含量为1%-10% ;氮源为NaN03、KN03、NH4N03，浓度为 0.1%-1% ;缓冲盐为 K2HP04、KH2P04、Na2HP04、NaH2P04，浓度为 0.5%-2% ；PH为6-9 ;摇床转速为100-200rpm/min，培养10-100小时后，测定底物转化率ZZG-1、ZZG-2、ZZG-3中底物栀子苷转化率分别为96.7%,47.8%,35.6%，选择底物转化率最高的菌种ZZG-1作为菌种鉴定的对象。
[0006]2、菌种鉴定
将菌种用PDA固体培养基活化后，从培养基上挑取菌丝至显微镜下观察:菌株气生菌丝较发达，菌丛具条纹，密厚；小孢子产生早而多，大孢子产生于多分枝的分生孢子梗上白色，后期培养皿反面变为蓝绿色。
[0007]该菌种接种于PDA固体培养基中活化后，再转接至PDA液体培养基中，离心后取菌丝，参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA，配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，完成后经1%琼脂糖凝胶电泳，观察并拍摄结果。将得到的菌株ITS序列用GenBanK中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行分析，结果其与腐皮镰孢菌iFusarium solani (Mart.))属菌种相似性达100%，故判断其为腐皮镰孢菌iFusariumsolani (Mart.))。本菌株已于2014年9月I日起，保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC N0.9580。
[0008]3、菌种培养
从保藏培养基(PDA)中挑取腐皮镰孢菌QFusarium solani (Mart.))菌丝接种于PDA固体培养基(去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为水，自然pH值)中，于25_35°C培养72-120h，挑取PDA固体培养基中的菌丝接种与PDA液体培养基(PDA液体培养基中加琼脂20g/L)中活化培养48-72h，按体积比3-10%接种量，转接入液体产酶培养基(50%栀子苷20g/L，NaN033g/L，KH2P0440g/L 其余为水，用 NaOH 调 pH 至 7.5)，25_35°C下，培养 72-120h0
[0009]4、酶学特性
产酶培养基离心去除菌丝后，测得培养液β -葡萄糖苷酶酶活达77.83±0.42 U/mL，盐析收集沉淀、透析除盐后用聚乙二醇-6000包埋浓缩备用。
[0010]对该酶的最适反应温度及热稳定性、最适pH及PH稳定性、反应时间对酶活性的影响、金属离子和有机溶剂对酶活性的影响进行检测:该酶最适反应温度在45-50°C之间，最适pH在7-8之间；在温度5-40°C，pH为6_9条件下，酶可以保持较高活力，最适反应时间为40min，金属离子和有机溶剂都对酶活性影响都很大。
【附图说明】
[0011]附图1栀子蓝色素扫描光谱。
[0012]附图2腐皮镰孢菌系统发生树。
[0013]附图3酶学特性。
[0014]附图4发酵前后培养基中栀子苷的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0015]实例I菌种筛选
取新鲜盾叶半夏植株，用无菌水冲洗干净，切成0.5cmX 0.5cm的小块，经过紫外消毒，75%乙醇消毒lmin，2.5%次氯酸钠消毒lOmin，再用75%乙醇消毒lmin，无菌水冲洗2?3次，接入已倒好的PDA固体平板培养基上。将培养皿置于28°C培养箱中倒置培养3?7天。待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，分别挑取各平板上的菌落边缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化得到3株植物内生真菌分别命名为ZZG-1、ZZG-2、ZZG-3，将他们分别添加到栀子苷粗提物培养基培养，该培养基中:栀子苷含量为2%、氮源为NaNO3、浓度为0.3%、缓冲盐为Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04、浓度为0.5% ;pH为7.5 ;摇床转速为150rpm/min，培养100小时后，检测其最大吸收波长为594nm(其扫描光谱见附图1)，在594nm波长下检测各组培养液吸光值，选择吸光值最大培养液中添加的菌种ZZGl作为菌种鉴定的对象。
[0016]实例2菌种鉴定
将菌种用PDA固体培养基活化后，从培养基上挑取菌丝至显微镜下观察:菌株气生菌丝较发达，菌丛具条纹，密厚；小孢子产生早而多，大孢子产生于多分枝的分生孢子梗上白色，后期培养皿反面变为蓝绿色。
[0017]该菌种接种于PDA固体培养基中活化后，再转接至PDA液体培养基中，离心后取菌丝，参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA，配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，将PCR扩增产物进行纯化，完成后经1%琼脂糖凝胶电泳，观察并拍摄结果。测得片段长度为554bp (见核苷酸序列附加文件)将该序列提交Gene Bank进行Blast同源序列分析，亲缘关系相近的序列大部分为腐皮镰孢菌solani(Mart.))属的菌株，构建系统发生树(见图2)，该菌种与它们都具有100%的同源性，该菌种为腐皮镰孢菌 iFusarium solani (Mart.))。
[0018]实例3产酶菌种培养
从保藏培养基(PDA)中挑取腐皮镰孢菌solani (Mart.))菌丝接种于PDA固体培养基(去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为水，自然pH值)中，于28°C培养72h，挑取PDA固体培养基中的菌丝接种与PDA液体培养基(PDA液体培养基中加琼脂20g/L)中活化培养72h，按体积比3%接种量，转接入液体产酶培养基(50%栀子苷20g/L，NaN033g/L，KH2PO4 40g/L其余为水，用NaOH调pH至7.5)，32°C下，培养120 h。在试管中取0.1 m L培养液，加入0.9 mLpH 6.2的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲溶液，于45 V水浴预热1min ;加入已预热10 min的ImL 5mmol/L栀子苷溶液，反应1min后立即用沸水浴终止反应，冷水冲淋后，室温放置5min，HPLC测定发酵液中栀子苷含量，同时检测发酵液中葡萄糖苷酶酶活力达77.83±0.42 U/mL。
[0019]实例4酶学特性
1、酶的最适反应温度及热稳定性
在 25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C和 70°C 的不同温度下，测定酶活力，确定温度对酶活力的影响；在4°C和上述各温度下各保温1h后，在最适反应温度下测酶活，确定酶的热稳定性。该酶的最适反应温度在45-50°C之间，当温度超过60°C时