腹泻性贝类毒素大田软海绵酸单克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋生物病原研宄技术领域，具体涉及一种腹泻性贝类毒素大田软海绵酸单克隆抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002]腹湾性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP)是由海洋藻类或微生物产生的一类脂溶性次生代谢产物。由于滤食性贝类摄食这些产生DSP毒素的藻类和微生物后可使毒素在体内蓄积，从而会导致食用者出现严重的腹泻、呕吐及下腹疼痛等症状，甚至危害生命。这类毒素对热稳定，且目前尚无特效解毒剂，一般采取对症处理的方式进行患者的救治。因此，加强对此类毒素的检测成为有效预防食用中毒事件发生的唯一措施。
[0003]目前，DSP的检测方法主要有小鼠生物测定法、生物免疫法、磷酸酶活性抑制检测法及高效液相色谱法等。大多数国家和地区包括我国在内，均将小鼠生物测定法做为DSP的标准测定法，其主要缺陷是操作繁琐、缺乏特异性(即不能鉴别DSP毒素的各种成分)、动物死亡时间的判断受主观因素以及实验室动物喂养和处死情况的影响。另外，由于其它脂类的干扰可能得到错误的结果(特别是游离脂肪酸对小鼠毒性影响很大)。近几年发展迅速的HPLC法是唯一能定性、定量检测出各种毒素组分的技术。但该法存在测定时间长、需要昂贵的仪器及专业知识和对样品制备要求高等缺点而难以在基层商检部门推广使用。随着ELISA检测试剂盒的出现，快速、灵敏、特异检测DSP得以现实。
[0004]在贝类质量管理及检测技术方面我国起步较晚，还很不完善，与发达国家相比存在着较大的差距。由于国外OA ELISA试剂盒价格昂贵，国内开发的试剂盒由于自身特异性、交叉反应等问题而未得到广泛推广。随着我国经济的快速发展和对外贸易水产品交易额的不断增加，迫切需要科研工作者研制出一种的高效、快速、灵敏、价廉的ELISA快速检测试剂盒以用于现场检测。本发明研宄开发的高特异性抗OA单克隆抗体的大量制备方法将为OA ELISA快速检测法提供了基础。
【发明内容】
[0005]为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种腹泻性贝类毒素大田软海绵酸单克隆抗体的制备方法。
[0006]大田软海绵酸简称0A，本专利文件的其它部分如无特别说明，两者为相同含义。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
[0008]1、大田软海绵酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0009]I)制备大田软海绵酸完全抗原:利用活泼酯法成功制备了大田软海绵酸的免疫抗原 OA-1gG ；
[0010]2)获得稳定分泌抗OA抗体的杂交瘤细胞株:采用步骤I)制备的人工抗原OA-1gG小剂量短周期方案免疫健康Balb/c雌性小鼠，脾细胞与SP2/0细胞融合，获得稳定分泌抗OA抗体的杂交瘤细胞株；
[0011]3)单克隆抗体的大量制备:小鼠体内接种杂交瘤细胞，制备OA腹水；CA_AS法对OA腹水单克隆抗体进行了纯化。
[0012]2、根据权利要求1所述大田软海绵酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤I)具体如下:lmg0A、0.155mg N-轻丁二酰亚胺、0.285mg N，N双环乙烧碳二亚胺于60 μ LDMF中混均，室温孵育2h ;其中20 μ L反应液加入0.75mg IgG(溶于50 μ L 0.lmol/LNaHCO3)，另外40 μ L反应液加入0.95mg BSA (溶于50 μ L 0.lmol/L NaHCO3);室温继续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用适当体积的PBS (pH7.4)溶解，使其质量浓度为lg/L，-20°C保存备用。
[0013]3、根据权利要求1所述大田软海绵酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，
[0014]免疫健康Balb/c小鼠的方法具体如下:首次免疫用100 μ g OA-1gG与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2d ;3周后再用10yg OA-1gG与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫；此后每2周用50 μ g OA-1gG重复腹腔加强免疫；从第3次免疫后开始，每次免疫后1d间接ELISA法测定血清效价，效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫I次，3d后取脾脏进行细胞融合；
[0015]获得OA抗体的杂交瘤细胞株具体方法如下:脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇(PEG)的作用下进行融合，时间不超过2min，用培养液将PEG缓慢稀释；将融合细胞悬浮于HAT选择性培养液中，加入到含有小鼠腹腔巨噬细胞的96孔板内，每2-3d换液一次，待HAT培养液杀死其它融合细胞后，改用RPMI1640完全培养液继续培养；从融合后8d吸取培养液上清，用ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞；强阳性孔的杂交瘤细胞经3-4次有限稀释法克隆培养，至阳性率达到100%，所得细胞株即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0016]4、根据权利要求1所述大田软海绵酸单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体如下:先腹腔注射0.5?1.0mL降植烧(Pristane)或液体石腊于Balb/c鼠，I?2周后腹腔注射I X 16个杂交瘤细胞，接种细胞7?1d后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水的产生情况，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，收集腹水，腹水中单克隆抗体含量可达5?20g/L。
[0017]本发明的有益效果在于:通过对制备流程的优化，使得大批量制备腹泻性贝类毒素大田软海绵酸单克隆抗体成为可能，为进一步研制出具有高特异性、无交叉反应且灵敏、价廉的OA ELISA快速检测试剂盒提供了基础。
【具体实施方式】
[0018]下面对发明的【具体实施方式】进行进一步的详细说明。
[0019]1.免疫抗原(OA-1gG)和检测抗原(OA-BSA)的制备
[0020]lmg0A、0.155mg N-轻丁二酰亚胺、0.285mg N，N 双环乙烧碳二亚胺于 60 μ LDMF 中混均，室温孵育2h ;其中20 μ L反应液加入0.75mg IgG (溶于50 μ L 0.lmol/L NaHCO3)，另外40 μ L反应液加入0.95mg BSA (溶于50 μ L 0.lmol/L NaHCO3)，室温继续孵育2h ;未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用适当体积的PBS(pH7.4)溶解，使其质量浓度为lg/L，-20°C保存备用。
[0021 ] 本发明采用活泼酯法，在DCC作用下通过N-羟基琥珀酰亚胺作为中间物将小分子毒素OA偶联在大分子载体蛋白IgG和BSA上。OA不溶于水，而偶联反应是在水溶液中进行的，所以在此活泼酯法中需要加一定比例的DMF，既保证OA最大限度的溶解，又保证能够与水无限的混溶，使反应顺利进行。由于OA标准品很难制备，价格极其昂贵，此反应体积极其微量，因此偶联后未反应的小分子物质及副产物通过超滤离心法去除，以避免传统透析法对样品的浪费。
[0022]2.采用小剂量短周期方案免疫健康Balb/c雌性小鼠。
[0023]首次免疫用100 μ g OA-1gG与等量福氏完全佐剂混匀分3次腹腔注射，间隔2d ；3周后再用10yg OA-1gG与等量福氏不完全佐剂混匀，腹腔分3次免疫；此后每2周用50 yg OA-1gG重复腹腔加强免疫。从第3次免疫后开始，每次免疫后10d，利用上述步骤得到的偶联的检测抗原OA-BSA ELISA法跟踪检测抗体效价。效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫I次，3d后取脾脏，按常规方法进行细胞融合。
[0024]2.1饲养细胞的制备
[0025]在融合前12h，取一只没有免疫的健康Balb/c小鼠，眶下窦放血，颈脱位致死，浸入75%的酒精中消毒lOmin，取出，移入超净工作台，无菌剪开腹部皮肤，暴露腹膜，然后，用5mL注射器和16号针头将5mL预冷的HAT培养基打入小鼠腹腔，轻轻挤压腹部，重新吸出注入的液体，收取小鼠腹腔巨噬细胞。用HAT选择培养基稀释、调整细胞至2X105/mL，按100 μ L/孔加入到4块96孔细胞培养板中，置37°C 5% 0)2培养箱中培养。
[0026]OA抗原的用量对免疫效果有很大的影响，免疫剂量太低，不能刺激动物产生较强的免疫应答反应；免疫剂量太高，则会产生免疫耐受或使动物中毒死亡。本试验将10ygOA-1gG分3次腹腔注射，间隔2d，为首次免疫；3周后再用100 μ gOA-1gG,腹腔分3次免疫，间隔2d，为第2次免疫；第3次免疫剂量减半，这种小剂量短周期免疫方案能够在短时间内刺激机体产生抗体，并使其在较长时间内保持较高的水平，且毒副作用小，可为下步的细胞融合提供良好的脾细胞。
[0027]2.2免疫脾细胞的制备
[0028]将超强免疫3d的小鼠，眶下窦采血，分离血清，脱颈致死，放入75%酒精(或3%新洁尔灭)中，5min后无菌取出。在无菌橱内将小鼠放入平皿内，用灭菌的外科器械将脾脏取出，除去脂肪和结缔组织，用无血清1640洗液冲洗，放在120目无菌铜网上，用无菌的注射器内芯碾磨，碾磨完后静置2m