鉴别PRV强毒和PRV gG、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物疫病检疫检测技术领域，具体的，涉及鉴别PRV强毒和PRV gG基 因缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬（Pseudorabies，PR)是世界范围内广泛发生的一种猪的急性、高度接触性 传染病。该病传染性强，易继发细菌和其他病毒的混合感染或继发感染，主要以新生仔猪的 急性死亡及4周龄以上仔猪出现神经症状，妊娠母猪以繁殖障碍、流产、死胎及呼吸道症状 为特征。近年来，尤其是2012年，PR在我国相继发生，在23个以上省内流行，出现高发病 率和死亡率，新生及4周龄以内的仔猪突然发病，死亡率可高达100%等新的发病特点。该 病无特效药物治疗，成为危害养猪业的主要疫病之一。
[0003] PR病原为伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)，属于痕疼病毒科a痕疼病毒 亚科水痘病毒属的猪疱瘆病毒I型，基因组全长为150kbp。目前已在PRV中发现了 11种糖 蛋白，分别命名为gB、gC、gD、gE、gG、gH、gj、gK、gL、gM和gN。其中gD基因编码的gD蛋白 与gl蛋白形成复合体，参与病毒的吸附过程，是重要的免疫原性蛋白。gG基因是PRV中的 一个分泌性的非必需糖蛋白基因。gE基因编码的gE蛋白是一种促进细胞融合的糖蛋白，介 导病毒从细胞到细胞之间的扩散。影响PRV在猪体内的组织趋向性，是经三叉神经节侵入 中枢神经组织所必需的。
[0004] 目前，国内外使用最广的PRV基因缺失疫苗是gE基因缺失疫苗。美国使用gE、gG 和gC基因缺失疫苗。但在日本多使用gG基因缺失疫苗，我国生产的以鄂A株为亲本毒株 构建的T K7gG_/LacZ+基因缺失疫苗高安全性，免疫效果优于国外同类产品，在国内也广泛 应用。
[0005] 现已有的PRV诊断方法主要是针对全病毒抗体或gE抗体缺失的血清学ELISA诊 断方法，这些方法存在操作繁琐、技术要求和试验条件要求高、试验周期长等缺点，难以满 足快速、大量鉴别检测的需要，目前PCR检测方法针对PRV的单一基因的判断，无法满足快 速鉴别检测PRV强毒和PRV gG和PRV gE基因缺失疫苗毒的需要。因此建立一种快速、高 效、特异、敏感的检测方法，从而能同时对PRV强毒、PRV gG和PRV gE基因缺失疫苗毒进行 快速鉴别检测，对于PR的快速确诊具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种可快速鉴别检测PRV强毒、PRV gG基因缺失疫苗毒以及 PRV gE基因缺失疫苗毒的三重PCR检测引物。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述引物在PCR鉴别PRV强毒和PRV gG、PRV gE基因缺 失疫苗毒中的应用。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的发明人经大量比对GenBank中PRV gD、gG、gE基因 序列，选取PRV gD、gG、gE基因高度保守且具有型特异性基因的序列为模板，设计合成PRV gD、gG、gE基因特异性引物对，分别命名为PRV gD-F(Pl)、PRV gD-R(P2)、PRV gG-F(P3)、PRV gG-R(P4)、PRV gE-F(P5)和 PRV gE-R(P6);由此，提供了一种鉴别 PRV 强毒和 PRV gG 基因 缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物，具体的：
[0009] P1 :3' -GGAGGACGAG CTGGG GCTGC-5'（SEQ ID NO :1 所示序列）；
[0010] P2 :3' -CCACGCCCCG CTTGA AGCTG-5'（SEQ ID NO :2 所示序列）；
[0011] P3 :3' -ACACCCGCAC GCGCATCGAC-5'（SEQ ID NO :3 所示序列）；
[0012] P4 :3' -TCTCGGCGGC GGTCACGITC-5'（SEQ ID NO :4 所示序列）；
[0013] P5 :3' -GTCACCGAGG TCCCGAGTCC(SEQ ID NO :5 所示序列）；
[0014] P6 :3' -GCGTGTAGAG GCCCGTGTCG(SEQ ID NO :6 所示序列）。
[0015] 其中，P1和P2用于扩增PRV gD片段，片段长度为212bp。
[0016] P3和P4用于扩增PRV gG片段，片段长度为315bp。
[0017] P5和P6用于扩增PRV gE片段，片段长度为472bp。
[0018] 本发明还提供含有上述引物用于鉴别PRV强毒和PRV gG、PRV gE基因缺失疫苗毒 的试剂盒。
[0019] 其中，在本发明所提供的试剂盒中还可以含有阳性对照品和阴性对照品，阳性对 照品可以为灭活的PRV细胞培养物、PRV gE基因缺失疫苗毒以及PRV gG基因缺失疫苗毒。
[0020] 本发明进一步提供上述引物或试剂盒在PCR鉴别PRV强毒和PRV gG、PRV gE基因 缺失疫苗毒中的应用。
[0021] 可选的，所述应用包括以下步骤：
[0022] 1)提取待测样品总DNA ;
[0023] 2)以提取的待测样品总DNA为模板，以P1、P2、P3、P4、P5、P6为扩增引物，进行PCR 扩增反应获得扩增产物；
[0024] 3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0025] 可选的，所述待测样品可以为淋巴结、脑组织或三叉神经节。
[0026] 其中，本发明对提取所述待测样品总DNA的方法没有特别的限制，可以采用本领 域常规的总DNA提取方法进行。
[0027] 可选的，进行PCR扩增反应使用的反应体系以25yL计为：Pl、P2、P3、P4、P5、P6 的终浓度各为0.4 4111〇1/1，2\60 81^€61'112.5 1^，5"1^￡1139酶0.251^，猪伪狂犬 病毒DNA 2yL，用去尚子水补至25yL。
[0028] 可选的，？0?扩增反应条件为：94°〇51^11后，941：3〇8,631：3〇8,721：3〇8,35个循 环；72°C 10min。
[0029] 鉴定结果判定：阴性对照未扩增出条带，阳性对照分别扩增出212bp、315bp和 472bp条带，为试验成立，否则试验不成立；样品PCR产物中同时出现212bp、315bp和 472bp，表明该样品为PRV野毒感染样品；样品中同时出现212bp、315bp条带，表明该样品为 gE/PRV缺失疫苗株阳性；样品中同时出现212bp、472bp条带，表明该样品为gG/PRV缺失疫 苗株阳性；样品中只出现212bp条带，表明该样品为gG/PRV、gE/PRV双缺失疫苗株阳性；样 品中未出现任何条带判为PRV感染阴性。
[0030] 本发明所述的PRV gD/gG/gE三重PCR快速检测试剂及鉴别检测方法可实现一个 反应同时对PRV强毒、PRV gG基因缺失疫苗毒和PRV gE基因缺失疫苗毒进行快速鉴别检 测，可在3h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测PRV 强毒和PRV gG基因缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的要求。
【附图说明】
[0031] 图1为PRV gD/gG/gE三重PCR产物电泳图。
[0032] 图中，M. 100bp梯度DNA分子量标记，PL PRV阳性对照，P2. gG基因缺失疫苗毒阳 性对照，P3. gE基因缺失疫苗毒阳性对照，N.阴性对照。
[0033] 图2为PRV gD/gG/gE三重PCR敏感性试验
[0034] 图中，M. 100bp梯度DNA分子量标记，1. PRV gD/gG/gE基因阳性质粒（1. OX 107拷 贝 / y L)，2. PRV gD/gG/gE 基因阳性质粒（1. 0 X 106拷贝 / y L)，3. PRV gD/gG/gE 基因阳性 质粒（1. 0 X 105拷贝 / y L)，4. PRV gD/gG/gE 基因阳性质粒（1. 0 X 10 4拷贝 / y L)，5. PRV gD/gG/gE基因阳性质粒（1. OX 103拷贝 / y L)，6. PRV gD/gG/gE基因（1. 0X 102拷贝 / y L)， 7. PRV gD/gG/gE 基因质粒（1.0X101 拷贝/yL)，8. PRV gD/gG/gE 基因阳性质粒（1.0X10° 拷贝/UL)。
[0035] 图3为PRV gD/gG/gE三重PCR特异性试验
[0036] 图中，M. 100bp梯度DNA分子量标记，PL PRV阳性对照，P2. gG基因缺失疫苗毒阳 性对照，P3. gE基因缺失疫苗毒阳性对照，N.阴性对照，1. LP-PRRSV，2. CSFV，3. PPV，4. JEV， 5. SS2〇
[0037] 图4为PRV gD/gG/gE三重PCR应用试验
[0038] 图中，M. 100bp梯度DNA分子量标记，PL PRV阳性对照，P2. gG基因缺失疫苗毒阳 性对照，P3. gE基因缺失疫苗毒阳性对照，N.阴性对照。其中Pl、4-6、9、12、14、16、20-22、 24、27、31 为 PRV gD/gG/gE 基因检测阳性，？2、2、7、17、23,32 为？1^80/^基因&6基因缺 失弱毒）检测阳性、？3，11、13、19、26、29、33、35为？1^ §0/^基因诚基因缺失弱毒）检 测阳性。
[0039] 图5为PRV gD PCR方法对35份疑似样品琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
[0040] 图中，M. DL 2000Marker梯度DNA分子量标记，PL PRV阳性对照，P2. gG基因缺失 疫苗毒阳性对照，P3. gE基因缺失疫苗毒阳性对照，N.阴性对照，其中Pl、P2、P3、3-6、9、 11-14、16、19-22、24-27、29、32、33、35为？1^ 80基因检测阳性，其余样品为阴性。
[0041] 图6为PRV gG PCR方法对35份疑似样品琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
[0042] 图中，M. 100bp梯度DNA分子量标记，PL PRV阳性对照，P2. gG基因缺失疫苗毒阳 性对照，P3. gE基因缺失疫苗毒阳性对照，N.阴性对照，其中Pl、P2、P3、3-6、9、ll-14、16、 19-22、24-27、29、31、33、35为？1^ §6基因检测阳性，其余样品为阴性。
[0043] 图7为PRV gE PCR方法对35份疑似样品琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
[0044] 图中，M. 100bp梯度DNA分子量标记，PL PRV阳性对照，P2. gG基因缺失疫苗毒阳 性对照，P3. gE基因缺失疫苗毒阳性对照，N.阴性对照，其中P1、P2、3-8、10、13、15、17-18、 21-25、28、32-33为PRV gE基因检测阳性，其余样品为阴性。
【具体实施方式】
[0045] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0046] 实施例1PRV强毒、PRV gG基因缺失疫苗毒以及PRV gE基因缺失疫苗毒的三重PCR 检测体系的建立
[0047] 1.材料与方法
[0048] 1. 1 材料
[0049] 1. 1. 1 毒株
[0050] PRV分离株由河南省动物疫病预防控制中心实验室分离鉴定；PRVgE基因缺失疫 苗毒，PRVgG基因缺失疫苗和其他对照病毒或细菌株由河南省动物疫病预防控制中心实验 室保存。
[0051] 1.1. 2仪器和试剂
[0052] PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公 司产品；恒温水浴震荡器（HZQ-?，哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；台式高速冷冻 离心机，美国Heraeus公司产品；Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收试剂盒等均购自宝生 物工程（大连）有限公司，pGEM-T Easy载体、JM109感受态细胞购自Promega公司。
[0053] 1. 2 方法
[0054] 1. 2. 1引物设计和合成<