一种香港海鸥型菌的实时荧光pcr检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种PCR检测试剂盒，特别涉及一种香港海鸥型菌的实时荧光PCR检 测试剂盒及检测方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 香港海轉型菌（Laribacter hongkonggensis)为需氧及兼性厌氧，革兰阴性无芽 孢杆菌，分属奈瑟氏科。该菌是近20年来医学界发现的首种可致人腹泻，甚至严重肠胃炎 的新的致病菌，该菌最早见报于2001年，由Yuen等人从一位肝硬化病人的胸腔脓血中分离 出（菌株号HKU1)。可引起社区性胃肠炎和旅行者腹泻，其临床表现与沙门菌和空肠弯曲菌 引起的病征相似，多数病人出现水样腹泻，偶有血便，目前在香港、中国大陆、日本、瑞士、非 洲及中美洲相继被发现，淡水鱼已被证实为香港海鸥型菌宿主。
[0003] 目前香港海鸥型菌的检测和鉴定方法采用改良头孢哌酮麦康凯琼脂筛选可疑菌 落，用API 20NE作生化鉴定，并用纸片法进行药敏实验作进一步确诊。操作步骤复杂，周期 长，不便于快速确诊。
[0004] 本发明应用新型TaqMan-MGB探针，建立的香港海鸥型菌实时PCR方法，可用于检 测和鉴定香港海鸥型菌，为香港海鸥型菌病快速诊断提供科学依据。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的是根据香港海鸥型菌16S rDNA基因保守序列设计引物和TaqMan探 针，提供一种检测香港海鸥型菌的实时荧光PCR试剂盒及检测方法，可实现对香港海鸥型 菌快速、准确、特异检测。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种香港海鸥型菌的实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR 扩增反应液、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增反应液包括特异性上游引物、特异性下游 引物、荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述阴性对照为香港海 鸥型菌全基因提取物，阴性对照为灭菌蒸馏水，所述特异性上游引物、特异性下游引物和荧 光探针序列如下：
[0008] 上游引物：5' -ACT AGC CGT TGG AGA TT-3'
[0009] 下游引物：5' -GGT CGA CTT CAC GCG TTA GC-3'
[0010] 荧光探针：5' -FAM-CGG TIT CTG GTG GCG C-MGB-3'
[0011] 其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团。
[0012] 本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计及检测方法，试剂盒中其他组 成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作香港海鸥型菌的定性检测，也可加入标准菌 株标准品进行定量检测。
[0013] 进一步，优选所述PCR扩增反应液中特异性上游引物浓度为0. 24 y mol/L。
[0014] 进一步，优选所述PCR扩增反应液中特异性下游引物浓度为0. 24 ymol/L。
[0015] 进一步，优选所述PCR扩增反应液中荧光探针浓度为0. 32 y mol/L。
[0016] 进一步，优选所述PCR扩增反应液组成为：2XPremix Ex TaqTM12.5yl，50XRox Reference Dye II 0? 5 y 1，10 y mol/L 上游引物 0? 6 y 1，10 y mol/L 下游引物 0? 6 y 1， 20 y mol/L荧光探针溶液0. 4 y 1，待检样品DNA提取液2 y 1，再用dH20补足至25 y 1。
[0017] 本发明还涉及一种所述香港海鸥型菌的实时荧光PCR检测试剂盒的应用，具体所 述的应用按如下步骤进行：
[0018] (1)将待测菌株置沸水浴lOmin，lOOOOrpm离心5min，吸上清，获得待测样 品， -40°C保存备用；
[0019] (2)将步骤（1)提取的待测样品作为模板，利用香港海鸥型菌的实时荧光PCR检 测试剂盒的PCR扩增反应液进行扩增，95 °C预变性20s，95°C变性10s，57 °C退火40s，40个 循环；于57°C处采集荧光进行荧光检测，荧光检测模式选择FAM荧光，基线和阈值设定：基 线调整取3~15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照（H 20)检测 荧光曲线的最高点，若待测样品荧光增长曲线高度超过阈值，并呈良好的对数增长，Ct值小 于或等于35. 0,则判断为阳性，即样本中存在香港海鸥型菌；若Ct值大于35. 0或扩增曲 线低于基线，则判断为阴性；每次试验均设阴、阳性对照，若阴性对照结果Ct值小于或等于 35. 0,或者是阳性对照结果Ct值大于35. 0或扩增曲线低于基线，则判断为试剂盒失效。
[0020] 本发明建立了利用TaqMan-MGB荧光定量PCR技术检测香港海鸥型菌的方法，并经 检测模拟双盲食品污染样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了 PCR扩增技术，使得 细菌的检测敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了 常规PCR扩增的假阳性率。
[0021] 本发明的有益效果主要体现在：靶细菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规 PCR扩增的假阳性率；可实现对香港海鸥型菌进行快速、准确、特异检测。 (四）
【附图说明】
[0022] 图1中A为不同浓度香港海鸥型菌菌悬液进行实时荧光PCR扩增的Ct值曲线，曲 线 1-曲线 7 分别表示 3. 6 X 107cfu/ml，3. 6 X 106cfu/ml，3. 6 X 105cfu/ml，3. 6 X 104cfu/ml， 3. 6X 103cfu/ml，3. 6X 102cfu/ml，3. 6X lOcfu/ml浓度的菌悬液；B为标准香港海轉型菌菌 悬液的Ct值与菌浓度的标准曲线，Ct = -3. 538 X LOG (X)+13. 56, X为菌浓度，相关系数（r) 为 0? 999。
[0023] 图2为荧光定量PCR检测特异性结果曲线。 (五）
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0025] 实施例1 :特异性引物、焚光探针
[0026] 1、材料：
[0027] Premix Ex Taq TM(2X)购自 TaKaRa 公司，MX3000P 型定量 PCR 仪均为美国 STRATAGNE公司产品。
[0028] 2、引物及探针设计与合成：
[0029] 以香港海轉型菌（Laribacter hongkonggensis) 16S rDNA 基因序列〔Genebank 登录号：EU697019〕为模板，使用Primer Express?(V3. 0,美国ABI公司）软件分析 TaqMan-MGB引物和探针位点，从中选择最佳组合。
[0030] 上游引物：5' -ACT AGC CGT TGG AGA TT-3'
[0031] 下游引物：5，-GGT CGA CTT CAC GCG TTA GC-3，
[0032] 荧光探针：5' -FAM-CGG TIT CTG GTG GCG C-MGB-3'
[0033] 其中FAM(6_Carboxy-Fluorescein)为焚光报告基团，MGB(Minor Groove