一种通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种含有人类生物活性物质组合物的制造方法，特别是人类生物活性 物质来源于永生化细胞。具体来说，本发明提供了一种采集自体细胞制作的永生化细胞，在 适当的培养基和培养条件下获得人类生物活性物质组合物，获取的人类生物活性物质组合 物经分离提取后可用于个性化化妆品供美容及皮肤保养使用。
【背景技术】
[0002] 正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下生长、分裂，经过有限次的细胞传 代后就会停止增殖，出现衰老和死亡。永生化细胞是实现了永生化（immortalization)的 细胞，则具有无限分裂和增殖的能力，如生殖细胞、干细胞、肿瘤细胞和外源性基因转染而 构建的永生化细胞等。通常意义的永生化细胞是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因 素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力一类细胞，这样的细胞群体称为 永生化细胞系或连续细胞系。
[0003] 目前，建立永生化细胞系的方法是通过基因转染等技术，将外源永生相关基因转 入目的细胞或通过物化的方法诱导衰老相关基因发生突变，促使正常细胞永生化。经人工 转染的永生化细胞能无限增殖生长，可长期传代，但并不改变细胞本身的特性。具体方法包 括电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法以及逆转录病毒和腺病毒介导转染法；物理刺激 法通过X射线、电离辐射、C〇60等放射性因素进行细胞永生化的方法，可能破坏了细胞的衰 老机制，使细胞周期得到延伸或促进了与细胞永生相关基因的表达。比较常用的基因转染 技术是将肿瘤病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等转染正常组织细胞来构建。此外，研究细 胞永生化最常用的方法还有通过构建含端粒酶催化亚基（hT ERT)的表达载体，通过各种方 法来转染细胞获得永生化细胞。
[0004] 应用较为广泛的肿瘤病毒包括EB病毒、腺病毒、猴肾细胞病毒、多瘤病毒等。EB病 毒（epstein-barr virus，EBV)在体外能使13淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系， 它可能通过诱导其它细胞周期调控蛋白从而抑制了P53的促细胞衰老作用，使细胞永生。 导致B细胞永生的主要原因可能是端粒酶活性的提高。目前，可以直接用B淋巴细胞与EB 病毒共培养的方法是细胞实现永生，在其他细胞中的应用很少。猿猴病毒SV40是一种真核 细胞病毒，它的T抗原片段是最常用的整合片段，此片段能够整合进靶细胞核内并表达，可 导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的表型。近年来，人们通过野生型SV40 病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等，成功获得了多种永生 细胞株。其它病毒如人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV)已成功地将人的包皮细 胞、角化上皮以及乳腺、胰导管和口腔等的上皮细胞以及牛牙乳头成纤维细胞永生化。此 外，也发现腺病毒可有效永生化大鼠肾细胞。
[0005] 另一种常用的获得永生化细胞的方式是通过构建含端粒酶催化亚基（hTERT)的 表达载体，转染正常细胞来获得永生化细胞。端粒酶转染建立的永生化细胞是正常细胞，而 非转化细胞，这些细胞依然保持了正常细胞的生理特性，具有正常的生长速率和核型。另 外，hTERT介导的永生化细胞已通过了 Ml期和M2期，具有同胚胎干细胞一样的传代能力， 可以算得上是真正意义上的永生化。
[0006] 端粒是位于染色体末端具有稳定染色体及防止染色体末端融合等特殊功能的部 分。随着细胞分裂次数的增加端粒进行性缩短，当缩短到一定的限度即不能维持染色体的 稳定时，细胞失去分裂增殖的能力，进而衰老死亡。细胞端粒长度的保持需要激活端粒酶。 端粒酶（telomerase)则是催化合成并维持端粒一定序列的核糖核蛋白，由RNA和蛋白组 成，具有逆转录酶的活性。人类端粒酶复合物的分子量约为500-1500kDa。目前发现，所有 的细胞永生化都与端粒的维持有关。目前大家比较认同的细胞发生永生化的机理是M1-M2 理论，即进入Ml期后，在病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等作用下，促使细胞绕过Ml期继 续生长。经20-30次扩增后进入M2期，绝大多数细胞出现退化，凋亡，极少数细胞的端粒酶 被激活，不断合成端粒DNA来补充和延长端粒长度，维持染色体的稳定性使细胞度过M2期， 最终细胞发生永生化（褚嘉祐，中华民族永生细胞库的建立，2009 :9-12)。
[0007] 永生化细胞除了能在体外长期传代外，还具有很高的端粒酶活性。因此，利用永 生化细胞生产细胞活性物质能够克服正常组织细胞传代、增殖的限制，能够作为质量和遗 传物质均稳定的标准细胞系。实际上，永生化细胞除了具有较高的端粒酶活性之外，其本 身还能够分泌大量的细胞因子（Christian Unger 等 2009，Human Reproduction。24(10): 2567-2581)。然而，对永生化细胞产生的细胞因子的研究非常少，可能是目前只是将永生化 细胞作为一种保存遗传物质的方式，而对细胞本身的代谢特征还没有注意到。
[0008] 专利申请号为03134542. 5的专利公开了"一种使皮肤成纤维细胞永生化的方法"； 专利申请号为201010109274. 6的专利公开了"端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构 建方法";专利申请号为201010585718. 3的专利公开了"永生化人椎间盘髓核细胞体系的制 备方法"。这几个专利仅公开了通过不同细胞制作永生化细胞的方法，其中并没有涉及利用 其制造细胞生长因子等人类生物活性物质方面的内容。
[0009] 目前，应用的细胞因子，主要是采用人工化学合成或者遗传重组技术进行制造。 如专利申请号为200510069586. 8的专利公开了 "双功能表皮生长因子及其制备方法和用 途"；专利申请号为201010137435.2的专利公开了 "一种生产人表皮生长因子（EGF)的制 备方法"。也有专利将上述通过基因重组的细胞因子用于美容护肤领域，如专利申请号为 200710059770. 3的专利公开了"含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品 制备工艺和用途";专利申请号为201210139430. 2"基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长 因子融合蛋白及其制备方法和应用"。此外，也有通过干细胞的方法来大量制造细胞生长因 子的技术，如来自韩国的专利申请号为200680051716. 8,名称为采用脂肪来源成体干细胞 大量制造生长因子的方法。但因技术难度或细胞来源等问题，并未发现利用永生化细胞制 造细胞生长因子的技术出现。无论是人工化学合成的还是基因重组获得的细胞因子与人体 自身产生的细胞因子还是存在一些差异，如这些细胞因子都或多或少的存在过敏原，失去 特定的三维结构，活性弱。而自体细胞具有与个体高基因一致性，不存在过敏原，不会产生 免疫排斥。由自体细胞制成的永生细胞不会导致癌症，用于自体不会出现免疫排斥反应，并 且不受细胞来源核数量的限制，能够做到质量均一，活性稳定，因此，能够应用于个性化的 需求，具有非常广阔的应用前景。
[0010] 本发明人注意到已有细胞因子的诸多问题以及永生化细胞的诸多特点，拟采用体 细胞制作永生化细胞并在适当的培养基和培养条件下制造人细胞生长因子等生物活性物 质组合物。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法。该组 合物包含细胞因子以及端粒酶等多种生物活性物质。此组合物能够应用于自体使用，具有 优异的生物活性、免疫源性低、无排斥反应、制作周期短、取材方便、费用合理等特点。
[0012] 此外，本发明将提供一种安全、有效、个性化的化妆品。所述化妆品中含有通过永 生化细胞获得生物活性物质组合物，或者含有由此永生化细胞培养的含有上述生物活性物 质组合物的培养基。
[0013] 为了达到上述目的，本发明提供了利用永生化细胞制造生物活性物质组合物的方 法，所述方法包括以下步骤：1，制作永生化细胞；2,在无血清培养基中扩大培养所述永生 化细胞；3,通过中空纤维超滤系统分离纯化生物活性物质；4,对上述分离纯化的生物活 性物质进行检测。
[0014] 本发明中公布的方法能够解决现有技术中不能通过细胞培养途径有效获得细胞 生长因子等生物活性物质的问题。本发明的生物活性物质组合物具有提高细胞胶原合成、 促进成纤维细胞增殖、抑制UV光导致的角化细胞增殖的作用。生物活性物质组合物来源于 人体细胞，与人体自身的生物活性物质具有一致的三维结构和生物活性，具有确定的安全 性，较好的皮肤相容性。预期能够很好地应用于抗皱，美化皮肤，创伤愈合，去除疤痕。
【附图说明】
[0015] 图1是永生化B淋巴细胞显微镜照片；
[0016] 图2是永生化B淋巴细胞培养不同时间的生长因子浓度Elisa检测结果图；
[0017] 图3是永生化B淋巴细胞端粒酶活性检测结果图；
[0018] 图4是永生化B淋巴细胞培养基刺激成纤维细胞增殖结果图；
[0019] 图5是永生化B淋巴细胞培养基和生物因子刺激胶原生成Elisa检测结果图；
[0020] 图6是永生化B淋巴细胞培养基促进角化细胞UV防御功能检测结果图。
【具体实施方式】
[0021] 为实现上述目的，本发明提供了通过永