一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白 3FliCon融合蛋白及其应用，通过构建猪源肠毒素大肠杆菌的3个拷贝的鞭毛基因fliC重 组质粒pRSET-3FliCon，将其转入大肠杆菌表达融合蛋白。利用该融合蛋白制备的鸡卵黄抗 体能抑制ETEC在体外对上皮细胞的粘附，且抑制不同血清型的ETEC菌株。
【背景技术】
[0002] ETEC是引起新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最主要病原菌之一（Nagy et al.，1990;Harel et al.，1991)。其引起的腹泻死亡率上升，使得生产效率降低和治疗成 本增高，给畜牧业造成了巨大的经济损失（Gaastra and Svennerholm, 1996)。ETEC引起腹 泻的毒力因子主要包括：粘附素和肠毒素（Turner et al.，2006)，其能够形成多种毒力因 子以适应宿主（Smith and Halls，1967)。ETEC通过粘附素介导粘附肠粘膜上皮细胞，以便 细菌定殖并大量繁殖，随后分泌大量的肠毒素，造成肠粘膜上皮细胞的病理变化，引起腹泻 (Qadri et al. , 2005)〇
[0003] 在世界养猪业中ETEC是引起仔猪腹泻的主要的病原菌之一（Broes et al.，1988)。由于肠道大肠杆菌引起的一些疾病对养猪业造成了很大影响，引起人们对仔猪 管理方面的重视。现在仔猪腹泻较明显的主要导致出生1-7天新生仔猪腹泻和断奶后一周 的断奶仔猪腹泻（Amezcue et al.，2002;Verdonck et al.，2002)。ETEC引起的新生仔猪 和断奶仔猪腹泻对养猪业造成了巨大损失，主要体现为仔猪腹泻，导致生长停滞，提高死亡 率等（Verdonck et al.，2002)。据Gyles报道，在养猪业中，ETEC引起的腹泻是最普遍的 肠道疾病，全球每年100, 〇〇〇头腹泻仔猪中死亡率高达50% (Gyles，1994)。
[0004] 鞭毛主要是螺旋菌、弧菌及多数杆菌和少数球菌的细胞膜表面一种丝状结构蛋 白，不仅是细菌的运动器官，而且鞭毛与细菌毒力有关，它在细菌的趋化作用和运动性中起 重要作用（Bardy et al.，2003)。现有研究发现细菌的鞭毛能参与粘附粘膜和上皮细胞， 如：绿脓杆菌（Arora et al.，1996)、霍乱弧菌（Richardson et al.，1991)、幽门螺杆菌 (Eaton et al.，1996)、类鼻疽伯克霍尔德菌（Brett et al.，1994)。Chua等采用同源重 组技术对假单胞杆菌强毒株KHW的fliC基因缺失突变，研究发现该突变菌株无鞭毛，并且 在半固体琼脂培养基上无运动性。实验证明，与野生型假单胞杆菌相比，其繁殖能力并没 降低，但丧失了毒力功能。在感染老鼠后，从小鼠肺和脾中几乎分离不到该细菌。Jorge等 (2002)用肠致病性大肠杆菌（EPEC)感染3h的HeLa细胞，通过利用免疫荧光标记对鞭毛进 行标记，发现EPEC的鞭毛能够直接参与该细菌粘附宿主细胞，但发现其运动功能对其粘 附宿主细胞作用不大。
[0005] Koushik Roy等（2009a)发现人源的产肠毒素大肠杆菌（H10407)分泌的双伴侣 分泌蛋白EtpA (双伴侣胞外分泌蛋白）能够介导鞭毛与肠上皮细胞（HCT-8和Caco-2细胞 系）粘附过程。通过试验作者发现抗EtpA抗体和抗鞭毛蛋白抗体能够抑制多种H血清型 的ETEC粘附宿主细胞。为预防ETEC性腹泻提供两种具有一定广谱性的免疫抗原。在参与 粘附过程中，Koushik Roy等通过构建完整（l_498aa)和不完整的FliC蛋白（l_173aa和 174-498aa区域)进行免疫共沉淀捕获EtpA蛋白，发现完整的FIiC蛋白和不完整的FliC蛋 白（l-173aa区域）都能与EtpA蛋白作用，而不完整的FliC蛋白（174-498aa区域）不能与 EtpA蛋白作用，同时以完整的FliC蛋白和不完整的FliC蛋白（l-173aa区域）两个蛋白作 为免疫原都能起到抑制细菌粘附宿主细胞的效果，也进一步确定了参与粘附作用的主要是 鞭毛蛋白FliC的保守区域（l-173aa区域)。现有研究报道，猪源ETEC (F18ab)鞭毛蛋白 作为一种重要的毒力因子参与感染猪源细胞系IPEC-J2(Duan et al.，2012)。从而推测猪 源ETEC鞭毛蛋白可以作为一种候选蛋白作为预防仔猪腹泻的疫苗研制。
[0006] 大量研究结果表明，通过给幼龄动物提供外源抗体(包括血清抗体和卵黄抗体）能 够有效的提高被动免疫水平，对于预防和治疗细菌和病毒感染(特别是肠道腹泻）是一种较 为有效的途径（Hatta et al.，1993;王劼，2007)。
[0007] 基于以上研究背景，本研究以鞭毛蛋白FliC保守区域作为候选抗原，利用基因工 程方法克隆表达含3个拷贝的FliC保守区域的融合蛋白，获得大量目的蛋白。通过免疫新 西兰雄兔来生产针对FliC抗原的特异性多克隆血清抗体，旨在制备一种成本低廉的具有 预防仔猪腹泻的疫苗。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供了一种猪源ETEC3个拷贝基因fliC的重组质粒 pRSET-3FliCon，其序列为 SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供了一种含有重组质粒pRSET-3FliCon的基因工程 菌。将重组质粒pRSET-3FliCon转化入大肠杆菌（Escherichia coli)BL21 (DE3)，该基因 工程菌能够表达鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白。
[0010] 本发明还有一个目的在于提供了一种猪源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白3FliCon 融合蛋白，其序列为SEQ ID NO. 2所示。该融合蛋白免疫原性好，生产成本低。利用该融合 蛋白制备的兔血清抗体，可在体外有效抑制大肠杆菌粘附。将该蛋白免疫蛋鸡后，可获得具 有抗ETEC的鸡蛋。
[0011] 本发明还有一个目的在于提供了一种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC融 合蛋白的复性方法，方法简单，易行，采用SKL，氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽对表达的 目的蛋白进行复性。在后期免疫过程中获得了较高效价的卵黄抗体。
[0012] 本发明还有一个目的在于提供了一种利用3FliCon融合蛋白制备的卵黄抗体，该 卵黄抗体具有广谱性抑制ETEC粘附的作用。
[0013] 本发明最后一个目的在于提供了一种卵黄抗体在制备抗猪源产肠毒素大肠杆菌 免疫疫苗中的应用。
[0014] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0015] 一种重组质粒pRSET-3FliCon的制备方法（图1)，其具体步骤如下：
[0016] 在NCBI中查找序列号AY906918全长1464bp，保守区是5 z端的519bp。以猪源 产肠毒素大肠杆菌标准菌株K88ac为试验材料，设计引物。本发明克隆的重组质粒，是利用 多串联体构建技术等基因工程技术和利用BamHI和BglII-对同尾酶的原理，将3个编码 鞭毛5z端保守区的核苷酸序列插入原核表达载体pRSET-B中构建而成。将构建好的重组 质粒命名为pRSET-3FliCon，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 重组蛋白3FliCon诱导表达及提取纯化
[0018] -种猪源鞭毛蛋白3FliCon融合蛋白，其制备方法如下：
[0019] 将重组质粒pRSET-3FliCon转化大肠杆菌BL2KDE3)，以诱导物异丙基-0 -d-硫 代半乳糖苷（Isopropyl-0-d-Thiogalactoside，IPTG)做诱导表达。以不同的诱导温 度和诱导剂浓度进行优化表达条件，得到最佳诱导表达条件：37°C摇床培养至0D_达到 0. 5-1. 0,加入诱导剂IPTG至终浓度为0. 5mM，诱导培养3-4h，最终表达量达到45%左右，主 要以包涵体形式存在。诱导后的重组菌经压力破碎、变性和复性浓缩后得到3FliCon融合 蛋白，其序列为SEQ IDN0.2所示，采用Bradford法测定蛋白质浓度。
[0020] -种人源产肠毒素大肠杆菌鞭毛蛋白2FliC融合蛋白的复性方法，其步骤如下：
[0021] 接种菌株至300mL培养基中，诱导表达，从培养液中收集菌体，再重悬于预冷的 30ml的BufferA中，压力破碎仪破碎3-5次，离心保留沉淀，30ml BufferA重悬沉淀，缓慢加 入10%SKL，不停搅拌至沉淀溶解，溶液澄清，4°C静置2h。继续加入终浓度0. 2%的PEG4000、 600 y