利用ptc转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过化学诱导将外源基因转入灵芝的方法，尤其是涉及一种利用聚乙二醇-氯化钙转化缓冲液(PTC)将外源基因高效转入灵芝真菌的方法。
【背景技术】
[0002]灵芝是一种珍贵的药用和食用菌，由于对多种疾病尤其是当今医学上的一些顽症如肝炎、心血管疾病、癌症等具有显著的疗效，因而已引起了国际医学界的瞩目。中国、日本、韩国、英国、美国已广泛开展了灵芝的生化、药理、临床等方面的研宄。但是关于灵芝的分子生物学方面的研宄，目前很少见报道，迄今尚未有外源基因转入灵芝中的报道。为了进行灵芝的分子生物学研宄，建立一个高效的转化系统是必需的，也是利用现代基因工程定向改良灵芝的药用品质的前提。此外，灵芝作为一种对人体无任何毒副作用的大型药用和食用真菌，以它作为外源基因的受体菌，对人体安全可靠，具有与细菌、酵母菌等不同的独特优点，它是一种应用前景很广的异源基因表达系统。因此，通过基因工程技术建立稳定、高效的灵芝转化系统，对充分利用和开发灵芝这一珍贵的资源有着重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种利用PTC转化缓冲液将外源基因高效转入灵芝真菌的方法，以便建立稳定、高效的灵芝外源基因转化体系，从而能够直接有效地获得具有优良遗传性状或重要经济价值的表达产物的转基因灵芝新菌种，以成为一个全新的转基因载体。
[0004]本发明提供了一种利用PTC转化缓冲液将外源基因转入灵芝真菌的方法，所述的方法包括以下步骤:
(1)灵芝原生质体的制备:用PDA液体培养基于26-28°C，140-180rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝；接种3mL菌丝悬液到10mL MYG液体再生培养基中，130-200rpm摇床培养3天，然后离心洗涤得到新鲜的灵芝湿菌丝；用由2_3g溶壁酶溶解于10mL 0.6-0.8mol/L的渗透压稳定剂溶液而成的溶壁酶液，按每330_400mg灵芝菌丝体加ImL溶壁酶液计算，在30°C、pH值为6.0条件下酶解2_3小时；将所得原生质体用灭菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，0.5-0.8mol/L渗透压稳定剂洗涤，然后用STC洗涤，最后溶于ImL STC中；
(2)原生质体转化:取约2X17个灵芝原生质体，加入30-70μ? PTC转化缓冲液，再加入10-20M-g真菌表达载体、浓度为10-100mmol/L的ATA 20-50M-L和浓度为10_30mmol/L亚精胺5-20μ?，充分混匀后，冰浴45分钟；然后加入l_2mL STC缓冲液，室温静置25分钟；4°C8000g离心5分钟，然后用500μ? STC重悬后于4°C、5000g离心5分钟，再用l_2mL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28°C放置18-24小时后，取100μ?涂于含有lOOPg/mL HmB的MYG固体再生培养基平板；
所述的PTC转化缓冲液由终浓度为10-80%的PEG4000、1-1Ommo 1/L的CaCl2、1-1Ommol/L的Tris混合而成；
所述的STC缓冲液由终浓度为0.1-0.8mol/L的山梨醇、10-100mmol/L Tris.Cl、10-100mmol/L 的 CaClJg合而成；
所述的渗透压稳定剂为硫酸镁、葡萄糖或甘露醇。
[0005]所述的MYG液体再生培养基为:麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，胰蛋白胨I克，pH自然溶于0.1-1.0mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为IL ;所述的MYG固体再生培养基为:在所述的MYG液体培养基中加入15克的琼脂即得。
[0006]所述的真菌表达载体为含有外源目的基因的PAN7-1真菌表达质粒。
[0007]所述的外源基因为动物、植物或细菌来源的基因。
[0008]所述的外源目的基因为p53基因。
[0009]所述的灵芝为赤芝。
[0010]本发明优点在于:
一方面，本发明用溶壁酶将灵芝菌丝体酶解成原生质体，所制备的原生质体经精制、纯化后、利用PTC转化缓冲液，以纯化的灵芝原生质体作为受体细胞，将含有外源基因的真菌表达载体转入灵芝原生质体中，再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株，各步骤和参数设置恰当，使得转化效率高达60-100个转化子/ PgDNA.17转化子。
[0011]另一方面，本发明的方法能将外源基因高效的转化入灵芝中，并使之得到稳定的复制、传代和表达，成功建立了灵芝的高效转化系统。
[0012]总的来说，本发明方法所建立的灵芝转化系统为灵芝开辟了广阔的应用领域，将使灵芝这一宝贵资源得到更充分的利用和开发。具体说来，主要包括:
1.灵芝有着很高的蛋白质分泌能力，能正确进行表达产物的翻译后加工，包括肽链剪切和糖基化等，且糖基化的方式与高等真核生物类似，而且灵芝还是已经确认的安全菌株，对人体有益无害，并有成熟的发酵和后处理工艺，因而可以利用灵芝转化技术将一些重要经济价值的、来自高等生物的外源基因导入灵芝中表达，利用灵芝发酵方法即可快速、大规模、廉价地生产具有活性的外源蛋白质；
2.通过灵芝转化技术将一些与优良性有关的基因导入灵芝中，可在短时间内快速定向改良灵芝菌株，培养出优质高产的灵芝新品种；
3.在基础研宄方面，灵芝的转化作为真菌的基因克隆和表达系统，可用于基因分离、基因组结构、基因表达及其调控等方面的研宄，并且可为建立其它大型真菌的转化系统提供理论和实验依据。
【附图说明】
[0013]图1是用实施例2方法将含有p53基因的pAN7-l质粒进行转化处理后的灵芝原生质体在含有lOOPg/mL HmB的MYG平板上培养15天后的结果。
[0014]图2是从图1中的转化平板上随机挑取3个含有p53基因的抗性转化子，将这3株转化子先在不含HmB的MYG平板上连续传代5代后，再接种到一个含有lOOPg/mL HmB的MYG平板上培养3星期后的结果。
[0015]图3是将2个随机选取的实施例2方法得到的p53基因灵芝转化菌株和一株未转化的野生型灵芝菌株进行Southern blot分析的结果。其中，I号泳道为质粒pAN7_l(6.7kb长，酶切成线状质粒)的Southern blot的结果，作为正对照。2号泳道为野生型灵芝基因组DNA的Southern blot结果，作为负对照。3号泳道为转化株p53_l#基因组DNA不作酶切的Southern blot结果。4号泳道为转化株p53_2#基因组DNA不作酶切的Southern blot结果。5号泳道为转化株p53-l#基因组DNA BamHI酶切的Southern blot结果。
[0016]图4是p53浓度与OD63tl对应关系曲线。将上述两株p53基因灵芝转化菌株(同图3中的两个转化株)进行ELISA分析。
【具体实施方式】
[0017]下面对本发明提供的【具体实施方式】作进一步的说明。
[0018]实施例1
用PDA液体培养基于28°C，180rpm培养从斜面接种的灵芝菌丝体3天(灵芝菌种是赤芝，生物学分类名:灵芝Ganoderma lucidum(Leyss:Fr.)P.Karst，然后用接种刀剧烈搅拌菌丝3分钟。接种3mL菌丝悬液到10mL MYG液体再生培养基中，200rpm摇床培养3天，然后以4000rpm离心lOmin，去上清液，用0.6mol/L的硫酸镁溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。
[0019]称取I克灵芝湿菌丝，加3mL由2g溶壁酶(购自广东省微生物研宄所)溶于10mL
0.6mol/L的硫酸镁溶液中而成的溶壁酶液，300C、pH值为6.0条件下酶解2小时。将酶解液用灭过菌的八层纱布过滤纯化后，5000g离心5分钟，去上清液，用0.5mol/L甘露醇洗涤I次，再用15mL STC洗涤I次，最后溶于ImL STC中。将原生质体用血球计数板计数后，稀释到18个/mL，4°C保存备用。
[0020]取160μ1灵芝原生质体(约2 X 17个)，加入30μ? PTC转化缓冲液，再加入20μ?(约lOPg)含有外源目的基因的ΡΑΝ7-1真菌表达质粒(PAN7-1原始质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司，商品号:MLCC150115 ;插入的p53基因序列如SEQ ID N0:1所示;p53基因序列插入在pAN7-l原始质粒的BglII和SnaBI两个酶切位点之间)和50μ?、10mmol/L ATA (金精三羧酸，Aurintricarboxylic acid，购自 Sigma 公司，商品号 Sigma A1895)，5KL、20mmol/L亚精胺，充分混匀后，冰浴45分钟。然后加入ImL STC缓冲液，室温静置25分钟。4°C、8000g离心5分钟，然后用500μ? STC重悬后于4°C、5000g离心5分钟，再用ImL STC重新溶解原生质体沉淀，26-28°C放置18-24小时后，取100μ?涂于含有浓度为lOOPg/mL HmB(潮霉素B，Hygromycin B)的MYG固体再生培养基平板。15天后，转化子长出。转化频率约为60个转化子/^g DNA.17原生质体。
[0021]本实施例1中的MYG液体再生培养基为: