处理纤维素和木质纤维素材料的新型酯酶的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新型多肽和含有所述多肽的酶制剂，它们即使在升高的温度下也可用 于各种工业应用。所述多肽和含有所述多肽的酶制剂尤其可用于改善纤维素和木质纤维素 降解效率、可用于改善动物饲料的质量、可用于机械洗碗应用、可用于去污剂组合物、可用 于纸浆造纸、纺织、食品、烘焙或饮料工业。本发明还涉及多核苷酸、包含所述多核苷酸的载 体和宿主细胞，以及生产所述多肽的方法。
【背景技术】
[0002] 植物中的大部分碳水化合物都处于木质纤维素的形式，其基本由纤维素、半纤维 素和果胶组成。纤维素是高等植物的主要结构组分。半纤维素是主要含有不同的葡聚糖、 木聚糖和甘露聚糖的碳水化合物聚合物的异质组。果胶由存在于大多数初生细胞壁中的一 系列复杂的多糖构成。
[0003] 纤维素材料，即包含纤维素、半纤维素和/或木质纤维素的材料，在自然界中被许 多不同的生物体（包括细菌和真菌）降解，所述生物体产生能够水解碳水化合物聚合物的 酶。降解通常需要相继或同时发挥作用的不同纤维素酶。含有更复杂纤维素的底物的降解 需要范围广泛的不同酶。
[0004] 木质纤维素可通过发酵、然后水解成可发酵糖，而被转变成生物乙醇和其他化学 产物。在常规的木质纤维素变乙醇工艺中，首先对所述木质纤维素材料进行化学或物理预 处理，使得所述纤维素级分更容易进行水解。其后，水解所述纤维素级分以得到糖，所述糖 可被酵母或其他发酵性生物发酵成为乙醇并蒸馏得到纯乙醇。木质素作为主要副产物得 到，其可以用作固体燃料。
[0005] 加工木质纤维素生物质的方法已经在US7998713中发布，其公开了包括用氨 预处理生物质的方法。在预处理之后，用糖化酶组合、即纤维素-水解糖苷酶处理所述 生物质，以产生可发酵糖。所述糖然后与可发酵所述糖并产生乙醇的微生物接触。US 20080032344公开了处理生物质以从其中分别回收全纤维素和近天然木质素的方法，由此 所述木质素和全纤维素衍生的糖然后可经受不同的处理以产生燃料、化学品和/或新材 料。
[0006] 木质纤维素分解酶对生物质的加工在生物燃料、淀粉、纺织、去污剂、纸浆造纸、 食品、饲料或饮料工业中具有显著的潜在应用。在许多这些应用中，木聚糖酶与各种不同 的其他木质纤维素分解酶结合使用。在纸浆造纸工业中，木聚糖酶用于造纸中以减少木浆 漂白期间的耗氯量和有毒排放物，用于纺织加工中以减少或代替化学浸解，用于生物除污 /生物转化中以处理/再循环利用废物和产生生物燃料和精细化学品，和用于烘焙中以改 善面团的弹性和稳定性或烘焙产品的体积和抗陈化性质。W0 2011091260公开了用具有 木聚糖酶和纤维素酶活性的双重活性酶处理木质纤维素材料的组合物和方法。所述酶在 提高的pH和提高的温度下是稳定和有活性的。US20120036599公开了从Chrysosporium lucknowenseCl(现在重新鉴定为嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophile);Visser 等，2011)分离的新型真菌酶，其适合于生物质工艺、去污剂工艺、浆柏和纸的脱墨和生物漂 白、以及废物流的处理。
[0007] 降解半纤维素的酶，例如半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和酯酶，已经用于改善例 如在动物饲料组合物中植物细胞壁的分解。尤其是已经观察到阿魏酸酯酶与木聚糖酶协 同作用以从植物细胞壁释放阿魏酸。CN101228921公开了用于饲料的阿魏酸酯酶、纤维素 酶、木聚糖酶和葡聚糖酶的组合物，所述组合物通过酶学方式改善糖从动物饲料的释放。 US6143543公开了可从曲霉（Aspergillus)获得并具有阿魏酸酯酶活性的酶，其可用于制 备食物和动物饲料。US20090151026中公开了来自特异腐质霉（Humicolainsolens)的具 有阿魏酸醋酶活性的多肽。KUhnel等2012公开了ChrysosporiumlucknowenseCl的阿魏 酸酯酶，其在中性pH和高达45°C的温度下是最有活性的。
[0008] 酶的成本和水解效率是限制生物水解工艺在生物质转化中的广泛应用的主要因 素。木质纤维素糖化过程中酶复合物的水解效率取决于各个酶的性质和所述复合物内每种 酶的比率二者。除了改善所述酶复合物中各个酶的特性之外，通过影响纤维素酶的活性来 改善纤维素材料的酶促降解也是有益的。此外，需要优化酶复合物中的组分并增补协同作 用酶来改善水解效率。
[0009] 因此，对于降解纤维素底物、特别是木质纤维素底物的新的有效方法，并且对于可 显著改善所述纤维素材料的酶促降解并且还减少所需酶剂量的便宜的酶和酶混合物，仍然 有持续的需求。此外，对于不仅在中等温度下工作而且还在高温下工作、由此增加反应速率 并且能够利用高生物质稠度产生高浓度糖和乙醇的方法，也有需要。因为环境顾虑和消费 者需求，期望有替代的酶辅助技术。此外，对于可用于各种农业和工业应用并且允许设计更 灵活的工艺配置的酶和方法，也有需要。
[0010] 本发明旨在满足这些需要中的至少一部分。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供新型多肽和含有所述多肽的酶制剂，它们可用于不同的工业 应用，甚至是在升高的温度下。具体地，本发明的目的是提供多肽，所述多肽尤其可用于改 善纤维素和木质纤维素降解效率、可用于改善动物饲料的质量、可用于机械洗碗应用、可用 于去污剂组合物、可用于纸浆造纸、纺织、食品、烘焙或饮料工业。
[0012] 本发明的目的通过从嗜热毛壳菌（Chaetomiumthermophilum)或白马兰诺菌 (Melanocarpusalbomyces)获得的新型阿魏酸醋酶来实现。
[0013] 本发明提供了包含与SEQIDN0:11具有至少76%序列同一性或与SEQIDN0:12 具有至少73%序列同一性的氨基酸序列的阿魏酸酯酶，或其具有阿魏酸酯酶活性的片段或 变体。
[0014] 本发明还涉及选自下列的分离的多核苷酸：
[0015]a)包含如SEQIDN0:9或10中所示的编码序列的多核苷酸；
[0016]b)编码权利要求1的多肽的多核苷酸；
[0017]c)编码由a)或b)的多核苷酸所编码的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段具 有阿魏酸酯酶活性；和
[0018]d)包含与a)或b)的多核苷酸序列的核苷酸序列简并的核苷酸序列的多核苷酸；
[0019] 或这样的多核苷酸的互补链。
[0020] 本发明还涉及包含所述多核苷酸的载体，和包含所述载体的宿主细胞。具有保藏 号DSM26070和DSM26071的大肠杆菌（Escherichiacoli)菌株也被包括在本发明中。
[0021] 本发明提供了生产所述阿魏酸酯酶多肽的方法，所述方法包含以下步骤：用编码 所述多肽的表达载体转化宿主细胞，和在能够表达所述多肽的条件下培养所述宿主细胞， 以及任选回收和纯化所述多肽。
[0022] 本发明还提供包含至少一种所述新型阿魏酸酯酶的酶制剂和所述酶制剂在生物 质加工，优选在生物燃料、淀粉、纺织、去污剂、纸浆造纸、食品、烘焙、饲料或饮料工业中的 应用。
[0023] 本发明的酶制剂在纸浆造纸工业中具有重大的潜力，例如在脱墨以从纤维表面释 放墨中、在改善浆柏排水中、在获得造纸机的更好的运行性能方面和对所有类型的浆柏和 纸制品进行纤维改性方面。
[0024] 本发明还提供了用阿魏酸酯酶或包含所述酯酶的酶制剂处理纤维素材料和木质 纤维素材料的方法，其中所述方法包含将所述纤维性/纤维素材料与所述多肽或包含所述 多肽的酶制剂反应。
[0025] 在一个方面，本发明涉及改善去污剂组合物的织物护理性质或纺织品清洁效果的 方法，所述方法包括向所述去污剂组合物添加本发明的阿魏酸酯酶。
[0026] 本发明还提供了包含所述阿魏酸酯酶的去污剂组合物，并涉及改善去污剂组合物 的织物护理性质或纺织品清洁效果的方法，所述方法包括向所述去污剂组合物添加本发明 的阿魏酸酯酶。
[0027] 在一个方面，本发明提供了包含所述新型阿魏酸酯酶多肽的动物饲料。所述动物 饲料因此可以用于改善动物生长速率和饲料转化率。
[0028] 在从属权利要求中提出了本发明的【具体实施方式】。本发明的其他目的、细节和优 点将从以下附图、详细描述和实施例中变得显而易见。
[0029] 本发明人发现，本发明的新型阿魏酸酯酶和方法提供了增加纤维素酶酶混合物的 总性能并减少达到有效降解木质纤维素底物所需要的蛋白质负荷的可观潜力。所述新型阿 魏酸酯酶适用于降解不同的纤维素材料和木质纤维素材料，特别是与用于降解不同纤维素 材料或木质纤维素材料的酶例如纤维素酶和/或木聚糖酶组合。本发明的新型阿魏酸酯酶 有效减少通常在洗碗机的过滤器中发现的纤维性/纤维素纤维。本发明人还注意到，新型 阿魏酸酯酶对改善动物饲料的质量有益，因此用所述酶处理植物材料。此外，用阿魏酸酯酶 或包含所述酯酶的酶制剂处理纤维素材料和木质纤维素材料对除去木质素的棕颜色有益 并有降低纸制品强度的倾向，从而改善所述纤维的造纸性质。
[0030] 本发明人还发现，所述新型阿魏酸酯酶在宽温度范围内都很有效，并且虽然它们 在标准水解温度下改善纤维素分解酶的效率，但它们在高温下也很有效。这使得它们极好 地适合于既在常规温度下又在升高的温度下进行的变化的纤维素底物水解过程。在常规的 分开的水解和发酵过程（SHF)中，酶水解温度通常高于发酵温度。在所述水解中使用热稳 定酶提供了潜在的益处，例如在升高的温度下更高的反应速率、由于酶的比活度和稳定性 更高而导致的酶负荷量减少、关于工艺配置的灵活性提高以及污染风险降低。所述热稳定 酶与嗜温酶相比的全面稳健性也增加了酶在工业过程中的再循环性。总的说来，本发明可 以显著节约能量和投资成本。
【附图说明】
[0031] 下面将通过优选实施方式并参考附图来更详细地描述本发明。
[0032] 图1示意性地显示了用于表达里氏木霉（Trichodermareesei)中fae基因的盒。 fae基因在里氏木霉cbhl/cel7A启动子（cbhl启动子）控制下并通过利用里氏木霉cbhl/ cel7A终止子序列（cbhl终止子）确保转录终止。包含amdS基因作为转化标志。
[0033] 图2显示了用包含本发明的白马兰诺菌FAE(Ma_FAE)酶的酶混合物进行的甘蔗渣 底物水解的结果。在37°C和50°C下利用不同的酶混合物以2毫克蛋白/克总固体的剂量 对具有12%干物质的甘蔗渣底物进行水解。对照酶混合物和包含所测试的FAE蛋白的组合 物的详细组成被描述在实施例5中。在48小时水解时间之后从一式三份的试管取出样品， 并通过HPLC定量，其中测定木糖的浓度。
[0034] 图3显示了用包含本发明的FAE蛋白的酶混合物进行的磨碎的苹果/橙/小麦纤 维混合物水解的结果。为对照和含有FAE蛋白Ma_FAE或Ct_FAE的混合物示出了在50°