拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶5?阶基因与甲酸脱氢酶/??因的植物表达载体在制备吸收甲醛能力增强的双表达转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002]甲醛(HCHO)被广泛的用于化工合成、工业制造、医药合成等所涉及的化学领域及其他工业领域，尤其是在化学农药及其中间体合成领域甲醛有着举足轻重的作用。现代化学农药的生产过程中不能避免的要产生大量含甲醛的农药生产废水，这些农药生产废水中普遍含有大量的甲醛以及醇、苯、酚、三聚甲醛、甲缩醛等物质，由于废水中甲醛的存在使得其处理变得十分困难。而且按照国家标准《污水综合排放标准(GB8978-1996)》规定:二级排放标准的甲醛含量不得高于2mg/L，所以含甲醛的农药生产废水要直接排放不仅不符合环保要求，并且对动植物都具有严重的危害性。由于甲醛在工业生产中的用途很广，完全的限制是不现实的，所以必须对工业生产中甲醛废水进行无害化处理。另一方面随着生活质量的不断提高装修已成为现代生活的一部分，而装修所用的材料胶合板、细木工板、中密度纤维板和刨花板等含有大量HCH0，这是因为目前生产人造板材使用的多种胶粘剂比如脲醛树脂、三聚氰甲醛、胺基甲醛树酯、酚醛树脂等多以HCHO为主要成分，所以HCHO气体成为装修房间中空气污染的主要化学物质之一。
[0003]HCHO是一种广泛存在的有毒化学物质，它可以溶于水中以液态存在，也可以挥发成为气体以气态形式存在。HCHO可以被还原为甲醇也可以被氧化为甲酸，而这三种物质对生物都具有一定的毒性。其中HCHO由于含有羰基基团因此具有较强的亲电特征，其具有十分活泼的化学性质能与各种脂类、核酸和蛋白质发生非特异性反应，并能导致生物体内各种相关物质失去生物活性。HCHO对人和动物具有较强毒性，它能导致皮肤敏感并能引起皮肤炎症；HCH0也能进入呼吸系统并引起该系统出现变态反应，通过血液循环被运输到全身引起肺部病变、肝脏器官损伤、免疫调节能力下降等。如果我们长期使用含有HCHO的水，会引发胃部不适、免疫障碍、贫血以及引起神经性病变，会对生物体产生急性或慢性的危害。如果人们暂时留在含有低剂量HCHO气体的室内时会使人产生不舒服的感觉，而长时间呼吸微量的HCHO会导致慢性呼吸道疾病，鼻咽癌、结肠癌、脑癌、月经紊乱、妊娠综合症、新生儿染色体异常、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连、白血病、青少年记忆力和智力下降等。当房间内HCHO气体浓度升高时，可刺激人眼使人流眼泪并引起咽喉不适或疼痛。而人体接触更高浓度HCHO气体可引起咳嗽、恶心或肺水肿等不良反应，如果HCHO气体浓度达到30mg/m3时可致人死亡。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TD1、VOC等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。
[0004]甲酸脱氢酶(FDH)和丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)是植物一碳代谢的两个关键酶，FDH可将甲酸氧化为C02，SHMT介导Gly和Ser之间的相互转换。FDH和SHMT的表达可被多种非生物胁迫诱导，在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要作用。在拟南芥甲醛代谢过程中FDH能将甲醛代谢产生的甲酸氧化为C02，SHMT则催化Gly和5，1-13CH2-THF (四氢叶酸)的反应产生丝氨酸。FD_ 的表达都受甲醛胁迫的诱导。丝氨酸(Ser)是拟南芥甲醛代谢的重要产物之一，但在烟草甲醛代谢过程没有产生Ser。本研宄尝试利用PrbcS启动子在WT烟草叶片中过量表达拟南芥光呼吸途径的SHMTl产生转基因烟草，将烟草甲醛的碳代谢流引入Ser的合成，增强烟草对甲醛的抗性和吸收能力。
[0005]利用PrbcS启动子在转基因叶片中过量表达拟南芥甲酸代谢途径的FDH产生SHMT/FDBm基因烟草，用13C-NMR分析转基因烟草对2mM和6mM液体甲醛的代谢机制，结果表明在转基因烟草叶片中5?? /??的同时过量表达不能将甲醛的碳代谢流引入Ser的合成，但却能将甲醛的碳代谢流引入葡萄糖([U-13C]G1uc)的合成，在烟草中引入了一条新的甲醛代谢途径。双转基因烟草叶片甲醛代谢产生[4-13C]Asn、[3-13C]Gln、[U-13C] OA和H13COOH的量大于/??? 5M/7单转基因烟草，说明甲醛胁迫下FD_ 5?阶在转基因烟草叶片中的同时过量表达使烟草原有甲醛代谢途径的作用大大增强，这使得
转基因烟草对液体甲醛的抗性和吸收能力比F_ 5M/7单转基因烟草的强。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于将拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶堪因的植物表达载体与甲酸脱氢酶/??因的植物表达载体在制备吸收甲醛能力增强的双表达转基因植物中的应用，其中丝氨酸羟甲基转移酶基因的GenBank登录号为6899944，甲酸脱氢酶/??基因的GenBank登录号为6625952，制备含有拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因(即5?阶基因)和甲酸脱氢酶基因(即/??基因)的耐受甲醛的双表达转基因植物。
[0007]本发明所述的丝氨酸轻甲基转移酶基因SHM他cDNA来源于拟南芥(Arabidopsisthaliana), GenBank登录号为6899944，甲酸脱氢酶基因FD_ cDNA来源于拟南芥
{Arabidopsis thaliana), GenBank 登录号为 6625952。
[0008]本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的:
1、植物表达载体的构建
1.1 基因植物表达载体的构建
(1)从GenBank中查找拟南芥5?阶基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物:
上游引物 5’ GCATGCATGGCGATGGCCATGGCTCTTC 3’ (含有 5^1 位点)；
下游引物 5’ CTCGAGTTAGTTCTTGTACTTCATG 3’ (含有通ol 位点)；
上游引物5’端形成Sphl酶切位点；下游引物3’末端加ZAoI酶切位点，以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，通过PCR扩增得到5?阶基因的全长cDNA (1554bp)；
(2)回收并纯化5?阶全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-19T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD19-5M^;
(3)构建入门载体pENTR-PrbcS-5Mi7；用 Sphl 和 ZAoI 酶切 pMD19_5M^pENTR-PrbcS-^m回收5?於的cDNA片段和载体DNA片段pENTR，进行连接、转化感受态细胞，得到入门载体pENTR-PrbcS-5M^;
(4)构建植物表达载体pK2-PrbcS-5Mi7；通过Gateway技术的LR反应把克隆到植物表达载体PK2GW7中，获得SHMm因的植物表达载体PK 2-?rbc^~SHMT0
[0009]1.2 /??基因植物表达载体的构建
(1)从GenBank中查找拟南芥/??基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物:
上游引物 5，GCATGCATGGCGATGAGACAAGCCGCTAAGG 3，(含有 5^1 位点)；
下游引物 5’ CTCGAGTTACCGGTACTGAGGAGCAAGTTCA 3’ (含有通ol 位点)
上游引物5’端加GCATGC特征序列，并由此形成Sphl酶切位点；下游引物3’末端加Xhol酶切位点，以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，通过PCR扩增得到/??基因的全长cDNA(1155bp)；
(2)回收并纯化/??全长基因cDNA片段，并将其连接到PMD-19T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD19-/?7;
(3)构建入门载体pENTR-PrbcS-T*-/?^ 用 Sphl 和 ZAoI 酶切 pMD19-/^_PpENTR-PrbcS-T*-GFP，回收FDI^ cDNA片段和载体DNA片段pENTR，进行连接、转化感受态细胞，得到入门载体pENTR-PrbcS-T*-/?^;
(4)构建植物表达载体pH2-PrbcS-T*-/?%通过Gateway技术的LR反应把/??亚克隆到植物表达载体PH2GW7中，获得FD龜因的植物表达载体pH 2-PrbcS-T*-/m
[0010]本发明的植物表达载体对那些能实施转基因操作的植物都适用，如烟草、拟南芥、矮牵牛、非洲菊等。在本发明的实施中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。
[0011]2、烟草的转化
采用电转化转化质粒pK2-PrbcS-5MT进入农杆菌感受态细胞，涂布在Spe平板上生长两天后，用菌落PCR检测质粒是否转化到农杆菌中。PCR扩增用5Ζ?的上下游引物，扩增片段理论长度为1.6kb，PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，表明质粒已转入农杆菌中。制备烟草、Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，筛选具有卡那霉素(Km)抗性植株，将其转移到MS培养基(含有3%蔗糖)上继续培养，从而获得无菌的转基因烟草植株。
[0012]以已经成功筛选出的过量表达拟南芥5?阶烟草作为受体，将pH 2-PrbcS-T*-/W植物表达载体转入农杆菌(A.tumefaciens C58C1，pMP90)中。使用植物叶盘法由农杆菌介导将pH2-PrbcS-T*-/^%植物表达载体转化进入已经检测正确的过量表达拟南芥5?阶烟草中。转化完成后的叶盘置于25°C恒定光照(ΙΟΟμπιοΙ.πΓ2.s—1)下进行培养，转基因小苗需在含有卡那霉素(Km，50 μ g/ml)和潮霉素(Hyg，20 μ g/ml)的双抗性培养基上进行筛选，所得的再生苗中就有过量表达拟南芥SHMT/FDH烟草。
[0013]3、SHMT/FD龜因插入情况的检测
为了检测目的基因是否插入有卡那霉素和潮霉素抗性植株烟草的基因组，以抗性苗的基因组为模板，利用上下游弓I物做PCR检测，PCR扩增产物片段理论长度分别为1.6kb和1.2kb，PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，说明目的基因SHMT/已插入到烟草基因组中。
[0014]4、SHMT/m龜因转录水平的检测
为了检测目的基因在双表达转基因烟草中是否转录，提取抗性苗RNA，利用SHMm 上下游引物进行RT-PCR检测，RT-PCR扩增片段理论长度分别为1.6kb和1.2kb，RT-PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，说明目的基因SHMT/FDH烈?職因烟草中正常转录。
[0015]5、SHMT/FDm因表达水平的检测
为了检测目的基因/??编码的蛋白在双表达转基因烟草中是否表达，选取经RT-PCR检测正确的转基因株系的嫩叶，提取总蛋白进行Weste