一株金属硫蛋白细胞表面展示酵母及其在重金属吸附中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术和环境工程重金属污染治理领域，具体设及能够使金属 硫蛋白在细胞表面表达的整合载体和该载体的构建方法、W及转化该整合载体得到的能够 在细胞表面表达金属硫蛋白的转基因酵母和该酵母在制备重金属生物吸附材料中的应用。
【背景技术】
[0002] 来自工业废物的重金属对环境的污染，已经成为当今世界重要的环境问题之一。 重金属污染物主要来源于电锻业、冶金业、采矿业等，重金属污染物不可W通过化学或者生 物处理被降解成无毒物质，其不仅可W永久存在于环境中，而且重金属可W在食物链中积 累。环境和废水中重金属的去除成为社会关注的重要问题之一。
[0003] 目前除去水溶液中的重金属的方法主要有物理、化学和生物技术。重金属处理的 具体方法主要有化学沉淀、过滤、离子交换、电化学催化、膜技术、活性炭吸附、蒸发等，但是 该些方法通常比较昂贵并且效率比较低，尤其是在重金属浓度比较低（1-lOOmg/L)时，而 生物吸附方法与其他方法相比操作简单、高效快速、可W将重金属从PPt水平减少到ppb水 平。故重金属生物吸附法是目前有效解决重金属污染的方法之一，国内外对生物吸附法在 重金属吸附领域的应用做了大量的研究工作，其中，由于金属硫蛋白可对重金属特异性结 合而被应用于重金属吸附的研究。
[0004] 金属硫蛋白是一类富含半脱氨酸、低分子量（3500-14000Da)、可被金属诱导表达 的蛋白质，金属硫蛋白的半脱氨酸残基上的琉基可W结合生理重金属（如化"、化"）和外 源重金属（如〔(1"、虹\43"、433+)，金属硫蛋白中的琉基含量占氨基酸残基的30%。有许 多研究表明，金属硫蛋白在细胞内可W提高微生物对重金属化"、Cd"、化"、化化6\As3+ 等的耐性和吸附能力。而金属硫蛋白在细胞表面表达时，其可W避免金属离子的跨膜问题， 金属硫蛋白可在细胞外直接结合金属离子，该不仅可W提高吸附速率，而且可W降低金属 离子对细胞的损伤。Kuroda等W将酵母金属硫蛋白通过a-凝集素细胞表面展示系统表 达在酿酒酵母的细胞表面，随后Cd"的吸附率提高至27.lOnmol/mg细胞干重，但该展示系 统不能整合在酵母染色体上，酿酒酵母只有在筛选培养基中金属硫蛋白才能表达在细胞表 面，Kuroda文中所使用的酿酒酵母是营养缺陷型的不易实现工业化应用，并且Kuroda文中 的重组菌株对CcT和化等金属离子的吸附力也较低。目前还没有在细胞表面展示金属硫 蛋白的能够对多种重金属离子如Cd"、化"、化等均具有高效吸附重金属离子能力的工业酵 母细胞。Kuroda等W构建的重组菌株只对cd"吸附能力有提高，但是对化"和&都没有 明显的效果。
[0005] 参考文献：
[0006] [ 1 ]KurodaK,etal.AppliedMicrobiologyandBiotechnolo gy, 2003, 63(2) : 182-186.
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一株能够在细胞表面展示金属硫蛋白的W有效的提高酵 母细胞对重金属吸附能力的重组酵母，该重组酵母是通过能够使金属硫蛋白在细胞表面表 达的整合载体，将金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因和组成型启动子PpCKl基因整合到宿主 菌染色体上而获得的。
[000引本发明是采用如下技术方案来实现的；
[0009] 本发明的第一方面，提供一种能够使金属硫蛋白在细胞表面表达的整合载体，该 整合载体是通过SEQIDNO. 2所示的金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因和SEQIDNO. 3所 示的组成型启动子Ppc；Ki基因插入到载体抑0-2上而获得的。
[0010] 其中所述金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因包括a-凝集素（AGA2)基因和金属 硫蛋白基因（cupl)。
[0011] 本发明的第二方面，提供所述的整合载体的构建方法，包括如下步骤：
[001引 （1)采用PCR扩增反应从酿酒酵母S.cerevisiae288c的基因组DNA中克隆出 cupl基因，如SEQIDNO. 1所示；其中PCR扩增反应的引物序列为；
[0013]州pl-F ;CCGGAATTCATGTTCAGCGAATTAATTA
[0014]州pl-R ;CCGCTCGAGGTCGATTAAACTTCCTTC
[0015] (2)将cupl插入到游离载体pYDl的EcoR I和化o I两限制性内切酶位点之间， 获得重组载体pYDl/cupl ;
[0016] (3)采用PCR扩增反应从重组载体pYDI/cupl中克隆出金属硫蛋白细胞表面展示 盒子基因AGA2/cupl，如SEQIDNO. 2所示；其中PCR扩增反应的引物序列为；
[0017] AGA2-CUP1-F ；GCGGTCGACGCTGTAATACGACTCACT
[0018] AGA2-CUP1-R ；AGACCCGGGACTTGCCCAATTCTCTTA
[0019] (4)将步骤（3)的金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因插入到载体抑0-2的SalI 和SmaI两限制性内切酶位点之间，得到重组载体HAC;
[0020] (5)采用PCR扩增反应从酿酒酵母S. cerevisiae 288c的基因组DNA中克隆出组 成型启动子PpcKi基因，如SEQ ID NO. 3所示，并将其插入到重组载体HAC的BsiW I和Sal I两限制性内切酶位点之间，得到整合载体HACg ;其中PCR扩增反应的引物序列为：
[002U PpGKi-F ;GCACGTACGACTGTAATTGCTTTTAGTTG
[0022] PpGKi-R ;TACGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG。
[0023] 本发明的第=方面，提供一种在细胞表面展示金属硫蛋白的具有高效吸附重金属 离子功能的重组菌株，该重组菌株是通过本发明所述的整合载体，将SEQIDNO. 2所示的基 因和SEQIDNO. 3所示的基因整合到宿主菌染色体上而获得的。
[0024] 进一步地，所述的宿主菌为发酵性能良好的工业酿酒酵母S.cerevisiae4126。
[0025] 上述所述的重组菌株，W工业酿酒酵母S. cerevisiae 4126为宿主菌时的构建 方法为：将HACg线性化后转化酿酒酵母S. cerevisiae 4126,利用G418抗生素为筛选标 记，即可筛选到金属硫蛋白细胞表面展示酵母，将该金属硫蛋白细胞表面展示酵母命名为 S. cerevisiae HACg,金属硫蛋白在酵母细胞表面表达的原理如图2所示。a-凝集素包括两 部分Agal蛋白和Aga2蛋白，Agal蛋白在胞内表达后被分泌到细胞外，通过与细胞壁上的 0-葡聚糖共价结合W固定在细胞壁上；而Aga2蛋白N端通过二硫键与Agal蛋白，C端可 w与金属硫蛋白融合表达，从而实现金属硫蛋白在细胞表面表达。
[0026] 本发明的第四方面，提供本发明所述的重组菌株在制备重金属生物吸附材料中的 应用。具体应用方法为；将本发明的重组菌株在葡萄糖浓度为30g/L的YTO种子培养基中 培养16-1她，然后按照1 %的接种量转接到葡萄糖浓度为60g/L的YTO发酵培养基中，发酵 结束后，使用真空抽滤累收集菌体，用去离子水清洗3次，所得菌体即可作为重金属生物吸 附材料。
[0027] 本发明的有益效果：
[002引 1.金属硫蛋白表达方式的选择，许多金属硫蛋白对重金属吸附影响的研究选择使 用游离载体在宿主菌中表达，该存在的问题是，在没有选择压力的情况下，游离载体容易丢 失不易于实现工业化应用，而整合载体的表达可W很好的避免该一问题。
[0029] 2.金属硫蛋白表达位置的选择，当金属硫蛋白在细胞表面表达时，其可W避免金 属离子的跨膜而直接结合金属离子，W提高吸附速率，并且降低金属离子对细胞的损伤，可 W实