一种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种体外细胞凋亡模型的建立方法，尤其涉及一种脂多糖诱导奶牛乳 腺上皮细胞凋亡模型的建立方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺炎常发生于奶牛和奶山羊等反刍动物，是由病原菌引起的乳腺的一种炎症反 应，可导致严重的经济损失。目前，各国学者都试图探寻一种典型、廉价、易于建立的乳房炎 动物模型，用以研宄乳房炎的发病机理和寻求更好的防治药物。目前，国内外已有多篇报 道关于向奶牛、奶山羊和小鼠等动物乳腺内灌注病原菌和内毒素等方法制作乳房炎动物模 型，然而由于实验性奶牛和奶山羊乳房炎模型费用高，使其在临床实践中的广泛应用受到 限制。因此，建立一种符合临床发病机制的体外乳腺炎模型对研宄乳腺炎发病机理和防治 更具有重要价值和实际意义。
[0003] 乳腺是一个复杂的器官，由多种类型不同的细胞组成，这些细胞在乳腺的免疫生 物学方面都发挥着各不相同的作用。最新研宄结果表明乳腺上皮细胞在乳腺感染的过程中 可能存在主动的应对反应，但对其机制还了解甚少，是目前国内外研宄的热点。
[0004] 脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS)，是革兰氏阴性菌（G-)细胞外膜上一种大分 子结构成分。牛的乳腺对LPS的刺激非常敏感，乳腺内灌注LPS，能够诱导出明显的乳房炎 症状，同时可增加血液和乳汁中脂多糖结合蛋白和可溶性CD14的水平及炎性因子的释放， 其诱发的炎症反应和G-菌感染引起的炎症反应有着极其相似的地方，因此在临床上有着 极为广泛的应用。且已有研宄报道表明，在体外经LPS刺激，乳腺上皮细胞亦能分泌炎症相 关的介质来介导细胞损伤。
[0005] 故本发明通过观察不同质量浓度的LPS对奶牛乳腺上皮细胞增殖活性、凋亡比例 以及内部超微结构变化的作用，评估LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，可 为进一步研宄乳腺上皮细胞凋亡信号调控奠定基础，为奶牛乳腺炎发病机理及防治研宄提 供试验模型。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，本发明所 述脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法能够准确测定LPS诱导奶牛乳腺上 皮细胞凋亡模型的诱导条件。
[0007] -种脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，其中，包括如下步骤：
[0008] (1)培养奶牛乳腺上皮细胞，获取2-3代对数生长期细胞用于后续试验；
[0009](2)取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以IX 104个/孔的密度接种 于72个96孔板，随机分为6个试验组，用CCK-8法检测所述6个试验组的细胞抑制率；所 述6个试验组的设置条件为：向所述6个试验组96孔板每孔中分别加入含LPS的培养液 100 y L，6个试验组加入的所述培养液中LPS质量浓度分别为0、10、20、50、100和200 y g/ mL，所述6个试验组的作用时间段设置均分别包括3、8、16和24h ;每组/每时间段3个复 板；选取所述LPS质量浓度为0 y g/mL的试验组为对照组，对所述各试验组各时间段得到的 细胞抑制率进行统计学分析；找出所述细胞抑制率在40%~50%之间的所述试验组及其 作用时间段。
[0010] 经统计分析得出以下结果：所述细胞抑制率在40%~50%之间的所述试验组及 其作用时间段为50 y g/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞24h和100 y g/mL LPS作用于奶 牛乳腺上皮细胞8h。
[0011] (3)根据步骤（2)的结果，取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以5X105 个/mL的密度每孔吸取2. 5mL接种于6孔板，随机分成3个试验组，每组3个复孔；用流式 细胞术检测所述3个试验组的细胞凋亡率；所述3个试验组的设置条件为：向所述3个试 验组6孔板每孔中分别加入含LPS的培养液2. 5mL，3个试验组加入的所述培养液中LPS质 量浓度和作用时间分别为含〇 U g/mL质量浓度LPS的培养液作用24h、含50 y g/mL质量浓 度LPS的培养液作用24h、含100 y g/mL质量浓度LPS的培养液作用8h。选取所述0 y g/mL LPS作用细胞24h的处理组为对照组，并对所述各试验组细胞凋亡率进行统计学分析。找出 所述细胞凋亡率在40%~50%之间的所述试验组。
[0012] 经统计分析得出以下结果：所述细胞凋亡率在40%~50%之间的所述试验组为 100 y g/mLLPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h组。
[0013] (4)根据步骤（2)的结果，取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以5X10 5 个/mL的密度每皿吸取5mL接种于25cm2培养皿中，随机分成3个试验组，每组3个复皿， 用1 %琼脂糖凝胶电泳检测所述3个试验组的细胞DNA完整性；所述3个试验组的设置条 件为：向所述3个试验组25cm2培养皿每皿中分别加入含LPS的培养液5mL，3个试验组加 入的所述培养液中LPS质量浓度和作用时间分别为含0 y g/mL质量浓度LPS的培养液作用 24h、含50 y g/mL质量浓度LPS的培养液作用24h、含100 y g/mL质量浓度LPS的培养液作 用8h。选取所述0 y g/mL LPS作用细胞24h的处理组为对照组，比较分析所述3个试验组 细胞的DNA Ladder电泳图，找出具有典型细胞凋亡DNA梯状带电泳图谱的所述试验组。 [0014] 经比较分析得出以下结果：所述具有典型细胞凋亡DNA梯状带电泳图谱的所述试 验组为100 y g/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h组。
[0015] (5)根据步骤（3)和⑷的结果，选择所述LPS质量浓度100 y g/mL为作用浓度， 8h为作用时间，进一步从细胞形态学上验证所述奶牛乳腺上皮细胞凋亡时的内部超微形态 变化特征；取所述2-3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以5X 105个/mL的密度每孔吸取 2. 5mL接种于6孔板中，随机分成2个试验组，每组3个复孔，用透射电镜观察术检测所述2 个试验组的细胞内部超微形态学变化；所述2个试验组的设置条件为：向所述2个试验组6 孔板每孔中分别加入含LPS的培养液2. 5mL，2个试验组加入的所述培养液中LPS质量浓度 和作用时间分别为含〇 U g/mL质量浓度LPS的培养液作用8h和含100 y g/mL质量浓度LPS 的培养液作用8h ;选取所述0 y g/mL LPS作用细胞8h的处理组为对照组，找出所述细胞内 部超微形态出现典型凋亡特征的所述试验组。
[0016] 经比较分析得出以下结果：所述细胞内部超微形态出现典型凋亡特征的所述试验 组为100 y g/mL LPS作用于奶牛乳腺上皮细胞8h组。
[0017] 综合比较分析步骤（2)、（3)、（4)、（5)的结果得出如下结论：确定100 y g/mL LPS 作用于奶牛乳腺上皮细胞8h为建立脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的诱导条件。
[0018] 本发明所述脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，其中，所述步骤 (1) 具体包括如下步骤：
[0019] 采用组织块培养法获得奶牛乳腺上皮细胞，用含体积分数10%小牛血清的DMEM/ F12培养液作为基础培养基，于37°C、C0 2体积分数为5%培养箱中培养，经纯化后取所述 2-3代对数生长期细胞用于后续试验。
[0020] 本发明所述脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡模型的建立方法，其中，所述步骤 (2) 具体包括如下步骤：
[0021] 取所述2~3代对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，以1 X 104个/孔的密度接种于72 个96孔板，放入37 °C，C02体积分数为5 %的培养箱，常规培养24h至细胞80 %融合后，随机 分成6个试验组，吸弃上清后，向所述6个