一种具有催化dma合成dmapp功能的酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本专利属于生物技术领域，涉及一种以异戊稀醇（3-Methyl-2-buten-1-〇l，DMA) 为底物，利用酶催化合成异戊稀二磷酸Oimethylallyl diphosphate，DMAPP)的方法，特别 涉及具有催化合成DMAPP功能的酶的制备、应用及定点突变。
【背景技术】
[0002] 异戊二烯是合成橡胶的重要单体，其用量占异戊二烯总产量的95%，主要用于合 成异戊橡胶，其产量仅次于丁苯橡胶和顺丁橡胶而居合成橡胶的第三位。其次，异戊二烯也 是合成丁基橡胶的一种共聚单体，以改进丁基橡胶的硫化性能，但用量很少，异戊二烯还用 于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶，还可用于制造农药、医药、香料及黏结剂等。
[0003] DMAPP是生物合成异戊二烯途径中重要的前体物质，本专利描述了一种以DMA为 底物并直接利用一个酶对其进行两步磷酸化来合成DMAPP的方法。目前，自然界主要有两 条途径用以DMAPP的生物合成：甲羟戊酸代谢途径和4-磷酸甲基赤藓糖醇代谢途径。前者 主要存在于真核细胞和植物的细胞质中，而后者主要位于真细菌，绿藻和高等植物的叶绿 体中。随着越来越多古细菌基因组的测序和注释，也发现有类似甲羟戊酸的合成途径。异 戊二烯的聚合便生成了萜类化合物。
[0004] 萜类化合物是指具有（C5H8)n通式以及其含氧和不同饱和程度的衍生物，萜类化 合物在自然界中广泛存在，高等植物、真菌、微生物、昆虫、以及海洋生物，都有萜类成分的 存在。已知道的萜类化合物22000多种，萜类化合物是中草药中的一类比较重要的化合物， 现代药理学研宄表明，萜类成分中有些具有生理活性且具有药用价值，如龙脑，人参皂干， 植物胡萝卜素等，他们具有抗菌消炎、降血脂、降血压、促进肝细胞再生等活性。同时它们也 是一类重要的天然香料，是化妆品和食品工业不可缺少的原料。
【发明内容】
[0005] 本专利的目的是提供一种具有催化DMA合成DMAPP功能的酶。
[0006] 为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：
[0007] -种具有催化DMA合成DMAPP功能的酶IPK，包括选自以下（a)~（c)所述的多 肽：
[0008] (a)由SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 2或SEQIDNO. 3所示的氨基酸序列组成的多 肽；
[0009] (b)由（a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化 DMA合成DMAPP功能由（a)衍生的多肽；
[0010] (C)与（a)中的氨基酸序列有95 %以上同一性的氨基酸序列，且具有催化DMA合 成DMAPP功能的多肽。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种多核苷酸，选自如下（d)~（f):
[0012] (d)编码权利要求1中（a)~（c)所述多肽的多核苷酸；
[0013] (e)编码权利要求1中（a)~（c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；
[0014] (f)在严格条件下与（d)或（e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化DMA合 成DMAPP功能的多肽的多核苷酸。
[0015] 可选的，为（d)编码的多核苷酸为ipk基因，用于编码IPK，其基因序列为SEQID 腸.4或3￡〇10腸.5或3￡(>)10腸.6中所不序列，分别来自于11161'1]1(^13811^3(^(1(^11；[111111， Methanothermobacterthermoautotrophicum，Methanocaldococcusjannaschii。
[0016] 优选的，不改变IPK氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大 肠杆菌偏好（高频使用）的密码子，得到的基因序列为SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9中所示序列。核苷酸序列SEQ ID NO: 7为序列表中SEQ ID NO:4所示的DNA片段 优化后核苷酸序列；核苷酸序列SEQ ID NO:8为序列表中SEQ ID NO: 5所示的DNA片段优 化后核苷酸序列；核苷酸序列SEQ ID N0:9为序列表中SEQ ID N0:6所示的DNA片段优化 后核苷酸序列。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种含有编码IPK多肽多核苷酸的重组载体。
[0018] 所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物 细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的 基于17启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺 乳动物细胞中表达的MSXND表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何 载体都可以用于构建重组表达载体。
[0019] 优选地，所述重组载体为在pET-28a载体的多克隆位点，插入序列表中SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6所示DNA片段后，得到的重组质粒（pET-28a-ipk)。可 选的，克隆位点为Ndel酶切位点和Xhol酶切位点。
[0020] 本发明的另一目的在于提供一种转入了含有编码IPK多肽多核苷酸的重组载体 的重组宿主细胞。
[0021] 所述重组宿主细胞包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核 细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选的为大肠杆菌、酵母。
[0022] 本发明的目的还在于提供一种由IPK多肽经过定点突变改造形成的比活力高的 多肽，其特征在于：是对SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列进行定点突变改造得到的，所改造 的突变位点包括第44位的甘氨酸、第72位的缬氨酸、第129位的缬氨酸、第139位的异亮 氨酸、第140位的酪氨酸、第203位的赖氨酸中的任一个，或它们的任意组合。
[0023] 优选的，所改造的突变位点为第72位的缬氨酸和第140位的酪氨酸，或第72位的 缬氨酸和第203位的赖氨酸，或第140位的酪氨酸或第203位的赖氨酸，或第72位的缬氨 酸和第140位的酪氨酸和第203位的赖氨酸。
[0024] 进一步的，第44位的甘氨酸突变为丙氨酸；第72位的缬氨酸突变为苏氨酸或异亮 氨酸；第129位的缬氨酸突变为丙氨酸；第139位的异亮氨酸突变为缬氨酸；第140位的酪 氨酸突变为丙氨酸亮氨酸或缬氨酸；第203位的赖氨酸突变为丙氨酸。
[0025] 本发明的目的还在于提供一种利用具有催化DMA合成DMAPP功能的酶合成DMAPP 的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0026] 步骤一：合成具有编码催化DMA合成DMAPP功能的酶的基因，并将其构建在载体 上；
[0027] 步骤二：将该重组载体在宿主细胞中表达；
[0028] 步骤三：从表达成功的重组宿主细胞中提取纯化具有催化DMA合成DMAPP功能的 酶；
[0029] 步骤四：对步骤三得到的酶进行定点突变，以提高酶的比活力；
[0030] 步骤五：以DMA为底物，进行磷酸化反应，利用步骤四得到的酶催化DMA磷酸化生 成 DMAPP。
[0031] 本发明建立了全新的以DMA为底物，通过酶催化生物合成DMAPP的方法，并在此基 础之上，对该酶进行分子改造，提高酶的比活力，建立了一种原料价格低廉、合成途径全新 的异戊烯二磷酸生物合成方法。
【附图说明】：
[0032] 图1为重组质粒pET-28a-ipk_ta的质粒图谱示意图。
[0033] 图2为实施例3和实施例7中提取蛋白的12% SDS-PAGE电泳图
[0034] 图3为IPK-TA及突变体活