一种基因工程大肠杆菌op50品系及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因工程大肠杆菌0P50品系及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]饮食是影响动物寿命的一个非常重要的环境因素。所有动物都必须通过食物摄入养料来维持生命和生育，饮食还直接或间接影响动物的发育、代谢、行为和衰老。根据动物遗传组成和生理状态，饮食量不同、饮食中营养成分不同会造成不同的反应。饮食变化和异常饮食信号日益和人类疾病如肥胖、糖尿病、癌症和心血管疾病联系起来。
[0003]除了提供营养，饮食还间接通过肠道微生物来影响动物，例如动物肠道中的微生物帮助动物消化食物中宿主动物本身不能消化的纤维来生产短链脂肪酸，这些微生物还能合成一些微量营养物质如维生素。这些间接的饮食影响也同从糖尿病、抑郁症到自闭症等许多人类疾病联系起来。尽管现在越来越认识到饮食的重要性以及饮食信号对健康的影响，这其中的复杂机制使得研宄背后遗传基础的工作充满挑战。
[0004]线虫是在许多生物过程的研宄中广泛应用的模式生物，线虫以细菌为食，摄入的细菌在肠道中消化后为线虫提供养料。细菌利用环境中的化学物质，合成一些必需微量营养物质例如线虫自身不能合成的维生素。就这一点而言喂养线虫的细菌直接为线虫提供大量营养物质以及必须微量营养物质，这和哺乳动物中的情况是一样的。此外，线虫和人需要相似的必需营养物质以及相似的基础代谢通路，这使得线虫代表了一个研宄饮食的直接/间接影响包括宿主-微生物相互作用的非常易于遗传操作的模式生物系统。
[0005]0P50是Sydney Brenner在他第一次介绍线虫作为一种遗传模式生物时选择用来培养线虫的。自那以后0P50就成为实验室里标准的线虫食物。它是一种B系大肠杆菌，为尿嘧啶营养缺陷菌系，只能在培养板上形成较薄的菌苔，这样就方便于在显微镜下观察线虫的形态、发育及行为(Brenner，1974)。在过去40年里，几乎所有关于线虫基因表达、发育、代谢、行为和衰老等的实验数据都是用OP50收集的。RNAi是一种首先在线虫中建立起来的基因工具，从1990年开始，RNA干扰成为一种有力的遗传工具并使生物医学研宄革命性发展(Fire et al.，1998)。现在已被广泛用来描绘几乎所有线虫中的生物过程，包括很多RNAi的研宄，特别是大量的全基因组RNAi筛选。
[0006]但是关键资源的缺少阻碍了线虫模型在饮食信号研宄中的应用，尤其是不能在喂食不同食物的虫子上进行RNAi。在0P50中不能进行RNAi操作，所有RNAi数据都来自于一种K-12系大肠杆菌HT115，这种方法是基于给线虫喂食表达针对特定基因的双链RNA(dsRNA)的HT115细菌来引起基因沉默。对线虫来说0P50和HTl 15是两种在营养物质和代谢产物的量和组成上不同的食物，前者是正常饮食而后者是富营养的，因此这两种饮食会对线虫的基因表达产生不同影响，导致对线虫整个生命周期各方面产生不同影响，包括而不仅限于发育、代谢、行为和衰老。因为技术上还不能在喂食0P50的线虫上进行RNAi，我们还不能通过RNAi系统性地研宄饮食依赖对线虫生物特性分差调节背后的遗传基础。此外，因为OP50和HTl 15对线虫的影响不同，所以对比在HTl 15上的RNAi数据和文献中通过0P50得到的数据很困难，这些不仅对针对不同饮食反应的，还对旨在排除饮食差分影响的研宄造成很大的挑战。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种新的基因工程菌，可作为线虫的标准食物等，用来进行多种生物学研宄。
[0008]本发明提供的基因工程大肠杆菌0P50品系，在其基因组中，敲除了 rnc基因，且attB位点插入有T7RNA聚合酶部件。
[0009]大肠杆菌0P50DNA上的rnc基因编码产物为RNase III酶，RNase III酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。基因敲除是通过一定的途径使有机体特定的基因失活或缺失的技术。rnc基因被敲除后，其不能再合成RNase III酶，有效增加了细菌中双链RNA的表达量。敲除rnc基因的目的是破坏其基因表达，只要起到破坏该基因表达的目的即可。
[0010]大肠杆菌0P50DNA上的att (attach)位点记为attB，长度为23bp，位于b1和gal基因之间，分B、0和B’三个序列组分。在attB位点插入T7RNA聚合酶基因序列后，使得相应RNA的表达具备可诱导性。虽然K-12系大肠杆菌HT115携带一个分离自DE3原噬菌体溶源化导入的IPTG诱导T7聚合酶部件，此部件可以起始质粒上dsRNA的合成。然而大肠杆菌0P50缺少这一结构，且该品系是抗λ噬菌体的，无法利用DE3溶源化来导入IPTG诱导Τ7聚合酶部件，大肠杆菌ΗΤ115的这种结构特征并不能在0Ρ50上重现。
[0011]经过努力，发明人发现attB位点能够插入T7RNA聚合酶部件，T7RNA聚合酶部件特定插入到attb位点专一性重组需要的识别位点，没有插到promoter后面，重组DNA片段中自带启动子。
[0012]通过在大肠杆菌0P50基因组中联合进行这两处改进后，新的基因工程菌能够有效表达RNA，尤其是具有双链结构的RNA，如具有回文结构的RNA等，同时也保证了 RNA表达的丰度和具备条件诱导表达特性。
[0013]作为优选方案，上述基因工程大肠杆菌0P50品系中，rnc基因序列部分插入有miniTnlO转座子。通过miniTnlO转座子，该品系还获得了四环素抗性。
[0014]所述miniTnlO转座子的核苷酸序列如SEQIDN0.1?2所示。所述T7RNA聚合酶部件的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0015]miniTnlO 序列:
[0016]5’ - NGCTNAGCN — 3’ (SEQ ID N0.1)
[0017]3’ — NCGANTCGN — 5’ (SEQ ID N0.2)。其中 N 为任意碱基对。
[0018]SEQ ID N0.3:1PTG诱导的T7聚合酶序列参见序列表。
[0019]靶序列和共同顺序愈相似，则转位的频率愈高。很可能转位酶需要同时识别末端反向重复和靶序列二者方能发挥作用。
[0020]作为优选方案，上述基因工程大肠杆菌0P50品系，名称为大肠杆菌Escherichiacoli 0P50(xu363)，于2015年3月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCCM2015138。
[0021]本发明还提供了一种上述基因工程大肠杆菌0P50品系的制备方法，是将来自rnc_大肠杆菌K8024的miniTnlO转座子引入rnc基因中；将IPTG诱导T7RNA聚合酶部件插入到attB位点，得到基因工程大肠杆菌0P50品系。上述两个操作顺序不分先后，可以调换。
[0022]Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40?60bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来。PCR引物由两部分组成，靠近5’端的区域为与靶基因同源的序列(约40bp)，靠近3’段的区域(约20bp)与模板DNA互补。
[0023]作为优选方案，上述基因工程大肠杆菌0P50品系的制备方法，具体步骤为:
[0024]敲除rnc基因:通过质粒转染的方法将来自rnc—大肠杆菌K8024的miniTnlO转座子引入0P50的rnc基因中；
[0025]插入T7RNA聚合酶基因序列:通过Red/ET介导的同源重组一个两侧是两个FRT位点的卡那霉素抗性基因首先引入到大肠杆菌BL21 (DE3) ybhC和IacI基因中间，然后携带整个编码T7聚合酶的基因片段和此卡那霉素抗性组件通过PCR扩增并通过第二步Red/ET介导的同源重组插入到经rnc基因敲除处理的0P50的attB位点，最后再通过FLP介导的重组将卡那霉素抗性组件去掉，最终得到的菌经PCR测序确认，获得所述基因工程大肠杆菌0P50品系
[0026]本发明还提供上述基因工程大肠杆菌0P50品系作为秀丽隐杆线虫的食物在研宄饮食对动物生命活动影响研宄中的应用。
[0027]本发明具有以下有益效果:
[0028]1.实现了同时在OP50品系中破坏rnc基因表达以及增加T7聚合酶表达
[0029]线虫以细菌为食，因此常规思路是把产生针对特定线虫基因的dsRNA的质粒转入作为食物的细菌中，这使得细菌成为产生和释放dsRNA最方便的载体。有两个理由使得HTl 15被选为宿主菌:其一，它携带一个插入可以编码R