一种源于象草的巨大芽孢杆菌及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种源于象草的巨大芽孢杆菌及其用途，属于应用微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着生物质能源产业的兴起，象草schum.)及杂 交狼尾草因其生物量大，再生能力强，纤维素、半纤维素含量高，生态适应性强等特性，发展 为一种新型的能源植物。我国具有沿海滩涂、盐碱地、荒地、贫瘠地等大面积的宜能边际性 土地，目前生物质生产潜力超过2亿吨标准煤。在宜能边际性土地种植象草、杂交狼尾草等 能源草，开发生物质能源，符合我国"不与粮争地，不与人争粮"的能源发展目标。但是这些 区域生产条件较差，缺乏灌溉保障，盐碱危害严重，严重影响象草、杂交狼尾草等能源草的 生物质产量。
[0003]植物促生内生菌（Plant Growth-Promoting bacteria endophyte, PGPE)是指 一类能够定殖在植物体内，并与植物体形成特异的共生关系，并因此对双方都有益处的细 菌。植物促生内生菌可以通过固氮作用、分泌植物生长调节物质、合成铁载体及抑制一些 疾病的发生等方式促进植物的生长，此外，它们还具有促进土壤中营养物质的循环、调节土 壤结构、对污染的土壤进行生物修复等作用。研宄与开发优良高效的植物促生菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR)生物肥料，对提高土壤中营养物质的利用率、 减少农药和化肥的施用、促进植物的生长发育、增强植物对逆境的适应性及耐受性受有重 要作用。
[0004] 所以，研宄与开发优良高效的象草促生菌生物肥料，对增强象草、杂交狼尾草的 抗性，促进植株生长发育，提高其在沿海滩涂、盐碱地等边际性土地产量有重要意义。但 目前促生长植物内生细菌主要是来自水稻、玉米、小麦、甘庶、苹果、柑橘、高丛蓝莓、桑葚、 杏，还没有来源于象草的促生长内生菌的报道（（1) Kloepper, J.W. 1994. Plant growth promoting bacteria (other systems). In: Okon, J. (Ed.), Azospirillum/Plant Association. CRC Press, Boca Raton, pp. 137 - 154. ； (2) De Silva, A. , Petterson, K. , Rothrock, C. , Moore, J. Growth promotion of high bush blue berry by fungal and bacterial inoculants. 2000.HortScience35, 1228 - 1230. ； (3) Sudhakar, P., Chattopadhyay, G. N. , Gangwar, S. K. , Ghosh, J. K. Effect of foliar application of Azotobacter, Azospirillum and Beijerinckia on leaf yield and quality of mulberry (Morus alba), 2000,J.Agric.Sci.134, 227 - 234. ； (4) Esitken, A., Karlidag, H. , Ercisli, S. , Sahin, F. Effects of foliar application ofBacillus substilis0su-142 on the yield, growth and control of shot-hole disease (Coryneum blight) of apricot, 2002,Gartenbauwissenschaft67, 139 - 142 ； (5) Esitken, A. , Karlidag, H. , Ercisli, S. , Turan, M. , Sahin, F. The effect of spraying a growth promoting bacterium on the yield, growth and nutrient element composition of leaves of apricot (Prunus armeniaca L. cv. Hacihaliloglu), 2003, Tfes. 54，377 - 380.)。本发明提供的巨大芽孢杆菌pp02,是从象草中筛 选的优良促生内生菌菌株，能更有效地增强杂交狼尾草的耐盐能力，显著提高杂交狼尾草 苗期的产量，对其在边际性土地的种植有重要应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种象草巨大芽孢杆菌，该菌株具有产铁载体、固氮、产 IAA的特性，IAA产量达10. 57 y g/mL，且在植物根部定殖能力强，耐盐能力强，在5% NaCl (50g/L)培养基中能生长，是一种优良的植物促生内生菌菌株。能促进盐胁迫下的杂交狼尾 草苗的生长，对杂交狼尾草作为能源草在盐碱性边际土地上的推广种植有重要意义。
[0006]为了实现以上目的，本发明提供的技术方案是： 本发明提供一种象草内生菌，该菌是从象草植株中分离到的一株内生菌，经传统方法 及分子鉴定表明它属于巨大芽孢杆菌，命名为巨大芽孢杆菌PP〇2 PP〇2 )， 已于2014年7月4号在中国微生物保藏中心保藏，保藏号CGMCC 9415,保藏地址：中国北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所。
[0007] 本发明的象草内生菌巨大芽孢杆菌pp02,具有如下生物学特征： 1. 菌落形态特征：在LB固体培养基上生长良好，菌落较大而且厚，呈圆形，白色不透 明，表面较干燥有褶皱，边缘不整齐； 2. 菌体形态特征：杆状，末端圆，单个或成对排列，0. 75~1 ymX2. 75~5 ym，革兰氏阳 性； 3. 部分生理生化特征：可在LB培养基上良好生长，最适生长温度28 °C，最适生长pH 7. 0 ； 4. 遗传学特征：根据《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英，科学出版社，2001)， 本发明的巨大芽孢杆菌CGMCC 9415形态特征与芽孢杆菌属最接近，经16S rRNA通 用引物27F和534R进行PCR扩增部分基因序列（496bp)已向美国国家生物技术信息中 心（NCBI)的Genbank基因序列数据库提交，登录号为KM886123。该巨大芽孢杆菌CGMCC 9415 16S rDNA序列分析表明，与Genbank国际数据库中记录的最相似的菌株 舰DSM319 (NC014103. 1)的相似性为99%。因此，该该巨大芽孢杆菌CGMCC 9415 应属于巨大芽孢杆菌属（ifeciBys
[0008]本发明的象草内生菌巨大芽孢杆菌pp02,是按如下方法从象草中分离培养得到 的： (1) 取自江苏省农科院试验田的象草苏牧2号，取根部经表面消毒杀灭供试材料表 面微生物，加适量石英砂研磨，加无菌水混匀，100 y L涂布于LB固体培养基上，28°C，培养 48h； (2) 挑取单菌落在LB固体培养基上反复划线纯化，直到得到纯系菌株为止； (3) 将纯系菌株接种于LB液体培养基中，28°C培养18h，取菌液700 y L加入质量浓度 为50%的甘油300 y L，混合后置于-70°C冰柜中冷冻保存； (4) 将所得的纯系菌株，通过杂交狼尾草苗接种试验验证其促生长活性后，鉴定，并保 存菌种，其中一株分离纯化所得的内生细菌命名为PP〇2。
[0009]本发明的另一目的是提供该象草内生菌巨大芽孢杆菌pp02的应用。
[0010] 所述的内生菌用于促进植物的生长，可以通过以下方法验证： 将杂交狼尾草种子消毒，置于1/2 MS培养基，25°C，暗培养48小时催芽，将催芽后的 种子播种于装满蛭石的盆钵中，苗长至10天左右，用PP〇2发酵原液灌根，侵染3天后，开始 并每隔四天浇6mg/mL盐水，20天后测量苗高并称鲜重。
[0011] 所述的内生菌能在植物体内定殖，是按如下方法进行验证： 取上述灌根侵染巨大芽孢杆菌PP〇2 3天的杂交狼尾草苗的根，经表面消毒，石英砂研 磨，加无菌水混匀，100 y L涂布于LB固体培养基上，30°C，培养48h，观察菌落生长情况，并 随机挑取3个单克隆，摇菌，经16SrDNA测序对菌株进行分子鉴定，以未侵染的杂交狼尾草 苗根作为对照。结果表明，巨大芽孢杆菌PP〇2成功侵染到杂交狼尾草根内，LB固体培养基 上观察到菌落长出，测序结果也证明了其是巨大芽孢杆菌PP02。
[0012] 本发明对所述象草内生巨大芽孢杆菌PP02,具有固氮、产铁载体、分泌植吲哚乙酸 (IAA)等促生特性，其产IAA的量达10. 57 y g/mL ;侵染定殖能力强，接种试验证明灌根处理 三天，该巨大芽孢杆菌pp〇2就能够在植物体内定殖，侵染效率为4. 9cfu/g植物根鲜重；耐 盐能力强，在5%NaCl (50g/L)培