具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体的制备及应用，特别是一种具有中和活性的抗狂犬病 病毒单克隆抗体的制备及应用。
【背景技术】
[0002] 狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RV)引起的一种致死性人畜共患病，人 和所有温血动物对狂犬病病毒都易感。狂犬病在全世界广泛分布。狂犬病病毒属于弹状 病毒科（Rhabdoviridae)，狂犬病病毒属（Lyssavirus)。基因组是不分节段的单股负链 RNA，大小为12kb左右，编码5种病毒结构蛋白，分别为核蛋白（Nucleoprotein，N)、磷蛋白 (Phosprotein，P)、基质蛋白（Matrix protein，M)、糖蛋白（Glycoprotein，G)、RNA 聚合酶 (Polymerase protein，Large protein，L)。其中狂犬病病毒主要结构蛋白G为跨膜蛋白， 含有多个糖基化位点，糖基化信号为Asn-X-Ser/Thr。G蛋白构成病毒的表面突起，属于主 要保护性抗原，主要诱导机体产生保护性中和抗体。
[0003] 由于狂犬病病毒糖蛋白很难在体外表达纯化，因此针对狂犬病病毒糖蛋白的单克 隆抗体或者具有中和狂犬病病毒活性的单克隆抗体研宄相对较少，本发明以狂犬病病毒灭 活全病毒为免疫原，免疫小鼠，利用快速荧光灶抑制技术（RFFIT)从中筛选出具有中和活 性的抗体。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及应 用。
[0005] 本发明的目的是这样实现的：一种抗狂犬病病毒单克隆抗体，以狂犬病病毒 CTN-1V株灭活病毒为免疫原，所制备的单克隆抗体具有中和活性，特异性地识别狂犬病病 毒糖蛋白，其特征在于：所述的单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示， 轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0006] 产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于：所述的杂交瘤细胞是由小鼠的 脾细胞与SP2/0细胞经细胞融合产生，能够持续、稳定分泌中和狂犬病病毒活性的单克隆 抗体；所述的单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，轻链可变区氨基 酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0007] 所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于：选择成年BALB/c小 鼠，腹腔接种灭菌液体石蜡，每只小鼠〇. 6ml，2周后腹腔接种所述的杂交瘤细胞，待腹部明 显膨大，采集腹水；将腹水离心，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，用Protein G~ S印harose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为：pH2. 7, 20mM的 甘氨酸缓冲液，得到具中和活性的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。
[0008] 所述的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：
[0009] 以狂犬病病毒的CTN-1V株灭活，纯化后浓缩液为免疫原；
[0010] 动物免疫：取8只Balb/c小鼠，分两组，其中6只为实验组，将免疫原与福氏完全 佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100 y g ;另外 2只一组为对照组，采用PBS免疫，免疫方式采用0, 7d，14d，28d，在进行细胞融合前3天，经 腹腔注射含150 y g抗原的生理盐水溶液；
[0011] 检测免疫效果：小鼠剪尾采集血清15 y 1后采用快速荧光灶抑制试验RFFIT方法 检测中和抗体的活性，选用中和抗体活性值相对高的小鼠进行后续的杂交瘤细胞的制备；
[0012] 杂交瘤细胞的制备：按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以 500g/L的PEG4000进行融合；用HAT培养液选择培养，融合后10~15天，取上清采用快速 荧光灶抑制试验RFFIT方法检测分泌的可以中和狂犬病病毒的杂交瘤细胞株；有荧光信号 抑制者即可初步判定为阳性克隆；对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆；通过多 次细胞融合，经过2次亚克隆和RFFIT筛选，得到1株具有中和狂犬病病毒活性的，稳定分 泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，标记为CTN-mAbl ;
[0013] 应用CTN-mAbl杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测：采用RFFIT法检测细胞培养 上清中和抗体效价为8. 8IU/mL，该杂交瘤细胞系所得小鼠腹水的中和抗体效价为21. 4IU/ mL ；
[0014] 杂交瘤细胞系的传代培养：将上述杂交瘤细胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培 养基中继续进行培养、传代；
[0015] 杂交瘤细胞系的保存：取对数生长期的细胞，去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加 入10%二甲基亚砜保护液，轻轻吹散，使细胞悬浮；每细胞冻存管1. 0ml，棉花包被置-80°c 过夜，随后转入液氮罐保存；
[0016] 单克隆抗体可变区的测序：将上述杂交瘤细胞系细胞提取mRNA，反转录为cDNA， 使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列 测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列，即单克隆抗体的重链可变区氨基酸序 列如SEQ ID NO :1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示；将该序列进行比对 后未显示有相同序列，表明所获得的序列为两个克隆各自特异的序列。
[0017] 本发明还提供了所述抗狂犬病病毒单克隆抗体在制备狂犬病病毒疫苗抗原检测 中的应用。
[0018] 所述的应用为人用狂犬病疫苗糖蛋白抗原含量检测酶联免疫法ELISA。用所述的 单克隆抗体和抗狂犬病病毒的鼠多抗组合而成的双抗体夹心酶联免疫法ELISA ;具体操作 步骤为：将纯化的权利要求1所述的单克隆抗体包被96孔或48孔微孔板，200ng/孔；4°C 包被过夜，之后甩干孔内液体，抽真空封装；检测二抗为抗狂犬病病毒的鼠多抗；检测时将 疫苗适当稀释后取100 U 1/孔加到包被完毕的微孔板中，37°C温育lhr，PBS-T洗板3次，加 入适当稀释的抗狂犬病病毒的鼠多抗100 U 1/孔，37°C温育lhr，PBS-T洗板6次，加入适 当稀释的商业化的HRP标记的抗小鼠IgG抗体，37°C温育30min，PBS-T洗板6次，加入商业 化显色剂，显色后终止反应，记录450nm下的吸光度值；通过与标准品的吸光度值得比较而 计算出人用狂犬病疫苗中糖蛋白抗原含量。
[0019] 所述的应用还在于用所述的单克隆抗体和马抗狂犬病病毒IgG抗体进行金标制 成抗狂犬病病毒单克隆抗体的检测胶体金试纸条。
[0020] 检测胶体金试纸条的制备方法是：将纯化的权利要求1所述的单克隆抗体与马抗 狂犬病病毒IgG抗体分别固定在硝酸纤维素膜及玻璃纤维素膜上，组成狂犬病病毒免疫胶 体金双抗体夹心检测试纸条；其中加样孔下设有滤过垫，反应区包被有纯化的单克隆抗体 胶体金偶联标记物，检测线包被马抗狂犬病病毒IgG抗体，质控线包被有兔抗鼠免疫球蛋 白，质控线侧贴有吸水垫。
[0021] 本发明还提供了所述抗狂犬病病毒单克隆抗体用于制备治疗人感染狂犬病的药 物用途。
[0022] 本发明具有如下有益效果：本发明以狂犬病病毒灭活全病毒为免疫原，免疫小鼠， 利用快速荧光灶抑制技术（RFFIT)从中筛选出具有中和狂犬病病毒活性的单克隆抗体及 能够持续、稳定分泌中和狂犬病病毒活性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，利用该单克隆抗体 制备的检测制品可用于人用狂犬病病毒的检测和用于制备治疗人感染狂犬病的药物用途， 对于疫苗生产过程中的质量控制和用于人感染狂犬病的药物生产制备，均具有较强的应用 价值。
【附图说明】
[0023] 图1 :CTN-mAbl单克隆抗体SDS-PAGE电泳图 1 :Blank ;2:CTN-mAbl 单克隆抗体
[0024] 图2 :CTN-mAbl单克隆抗体亚型鉴别图
[0025] 图3:人用狂犬病疫苗糖蛋白ELISA检测标准曲线结果
[0026] 图4:狂犬病疫苗胶体金检测试纸条特异性结果
【具体实施方式】
[0027] 1实验材料
[0028] 1. 1免疫原：本例以狂犬病病毒的CTN-1V株灭活，纯化后浓缩液为免疫原。
[0029] 1. 2实验动物：Balb/c小鼠，6~8周龄，雌性，SPF级动物培养。
[0030] 1. 3培养基：DMEM培养基购于GbiCo公司；HAT、HT选择培养基。
[0031]1. 4福氏完全佐剂及PEG4000购于Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯产品。
[0032] 2杂交瘤细胞系的建立
[0033] 2. 1动物免疫
[0034] 取8只Balb/c小鼠，分两组，其中6只为实验组，将免疫原与福氏完全佐剂等体积 混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100 y g。另外2只一组为 对照组，采用PBS免疫。免疫方式采用0, 7d，14d，28d。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射 含150 y g抗原的生理盐水溶液。
[0035] 2. 2小鼠免疫效果检测
[0036] 小鼠剪尾采集血清15 y 1后采用RFFIT方法检测中和抗体产生情况，选用中和抗 体值相对高的小鼠进行后续的杂交瘤细胞的制备。
[0037] 2. 3杂交瘤细胞的制备
[0038] 按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000 进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10~15天，取上清采用快速荧光抑制灶试验 (RFFIT)检测分泌的可以中和狂犬病病毒的杂交瘤细胞株。有荧光信号抑制者即可初步判 定为阳性克隆。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
[0039] 2. 4杂交瘤细胞系的建立
[0040] 通过多次细胞融合，经过2次亚克隆和RFFIT筛选，得到1株具有中和狂犬病病毒 活性的，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，标记为CTN-mAbl。
[0041] 2. 5应用CTN-mAbl杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测
[0042] 采用RFFIT法检测细胞培养上清中和抗体效价为8. 8IU/mL。该杂交瘤细胞系所得 小鼠腹水的中和抗体效价为21. 4IU/mL。
[0043] 2. 6杂交瘤细胞系的传代培养
[0044]采用圆盘培养瓶（Costar，USA)，将上述杂交瘤细胞系在含有10 %胎牛血清的 DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定 传代，RFFIT检测培养液上清中和抗体可达10. 0IU/ml。
[0045] 以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌中和狂犬病 病毒的单克隆抗体。
[0046] 2. 7杂交瘤细胞系的保存
[0047] 取对数生长期的细胞，去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10 %二甲基亚砜保 护液（含10%二甲基亚砜、20%灭活胎牛血清，70% DMEM液），轻轻吹散，使细胞悬浮。每 细胞冻存管1. 〇ml，棉花包被置