一种蛋白亲和纯化IgY的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种蛋白亲和纯化IgY的方法。
【背景技术】
[0002]卵黄抗体(egg yolk antibody, IgY)是通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原，从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50?10mg的抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。
[0003]与哺乳动物免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗原结合位点，Fe片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG，且重链恒定区(CH区)数量多于IgG，而轻链小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使IgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点(PI)在5.7-7.6之间，在pH4.0?
11.0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失，而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活性，4°C储存 6 ?7 年活性下降仅 5% (Jaradat Z W，Marquardt R R.2000.Studies on thestability of chicken IgY in different sugars, complex carbohydrates and foodmaterials.Food and Agricultural Immunology, 12(4):263-272) ;IgY抗胃蛋白酶消化的稳定性较牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力则较强(Shimizu M, Nagashima H, SanoK, et al.1992.Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G.B1sciB1technol B1chem, 56(2):270-274)。
[0004]由于系统发生学距离造成哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG，卵黄抗体应用于检测也具有多方面的优势如:卵黄抗体与内风湿因子、人类抗鼠抗体(HAMA)没有交叉反应，无补体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反应。此外，禽类针对保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成为有关抗体研发的重要选择因素。
[0005]精制卵黄抗体必须解决卵黄抗体的提取和纯化两大技术问题。卵黄抗体为存在于卵黄抗体中的水溶性蛋白质，其总量仅为卵黄抗体固形物的10%，其余大部分是颗粒状的卵黄抗体高磷蛋白、脂蛋白、可溶性的低密度脂蛋白和少量色素，这些物质存在于卵黄抗体液中，使之甚为粘稠，容易变质，并可干扰HI等试验的进行，未经处理的卵黄抗体液注射到动物体内吸收较慢，且在注射部位易形成干酪样物质、肿大或坏死等，影响抗体的作用和肉的品质。如果不能彻底解决这一矛盾，那么蛋黄抗体的安全性得不到保障，不能应用于大规模生产。二是解决如何从蛋黄中获取高纯度的IgY的纯化技术问题。粗制高免卵黄液主要用于动物饲喂，针对肠道微生物进行预防治疗。由于粗制高免卵黄液中含有大量脂类及杂蛋白，存在注射困难、吸收不良、过敏反应、保存期短和运输不便等缺点。因此选择适当的方法纯化获得大量高纯度的IgY显得很重要。
[0006]由于IgY提取工艺的不成熟，没有特别的办法大量提取出高纯度的IgY。多数停留在用生理盐水稀释蛋黄这种十分原始的方法。传统用作IgY纯化方法有硫酸铵沉淀法，聚乙二醇沉淀法，水稀释法，超过滤法，凝胶过滤法，亲硫凝胶色谱法，和离子交换层析法，这些方法步骤复杂，耗时较长。在蛋黄中，丰富的脂蛋白通常通过氯仿变性和离心除去，IgY抗体回收率非常低。按照美国专利(5367054)操作方法使用水提、超滤、离子交换和硫酸铵沉淀的方法进行纯化IgY抗体，IgY的得率仅为31.6%。
【发明内容】
[0007]发明目的:本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一种蛋白亲和纯化IgY的方法。
[0008]技术方案:一种蛋白亲和纯化IgY的方法，包括以下步骤:
[0009](I)、蛋白M的基因克隆；
[0010](2)、构建表达载体，通过表达载体对蛋白M进行可溶性表达、纯化可溶性蛋白M ;
[0011](3)、将步骤⑵纯化后的可溶性蛋白M与NHS活化的琼脂糖凝胶4FF按照质量比1: (I?3)进行偶联，制作亲和纯化介质；
[0012](4)、将IgY抗体初级产物通过蛋白M琼脂糖凝胶柱进行亲和纯化，获得高纯度IgY，IgY抗体初级产物为等质量的卵黄液与蒸馏水的混合物；
[0013](5)、将纯化后洗脱所得IgY抗体溶液在PBS溶液中4°C过夜透析，PBS溶液的pH为 7.0 ?7.4 ;
[0014](6)、收集透析袋内液体即为高纯度的IgY抗体。
[0015]作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案:步骤(I)中蛋白M的基因克隆的模板采用的是人生殖支原体的基因组，设计引物，PCR克隆出长1182bp的目的基因片段，PCR条件是95°C 5分钟，95°C 30秒，58°C 15秒，72°C I分钟，72°C 10分钟，30个循环。
[0016]作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案:步骤(2)中蛋白M的可溶性表达的条件为:诱导剂是0.1?0.8mM 1?了6，28?37°0，220印111，诱导时间4?711。
[0017]作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案:步骤(2)中可溶性蛋白M的纯化方法包括以下步骤:
[0018](21)、用3?5个柱床体积的蒸馏水洗去蛋白纯化预装柱柱内的乙醇；
[0019](22)、用至少5个柱床体积的结合缓冲液平衡柱，结合缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、20mM咪唑和0.02wt% NaN3,结合缓冲液的pH为7.4 ;
[0020](23)、用注射器或蠕动泵将用滤膜过滤后的蛋白液上到柱上，蛋白液为表达蛋白M的大肠杆菌超声破碎后的上清液；
[0021](24)、用3个柱体积的洗涤缓冲液洗脱柱中上清液中的杂蛋白，洗涤缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、50mM咪唑和0.02wt% NaN3，其中洗涤缓冲液的pH为 7.4.’
[0022](25)、用3个柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱中蛋白M中目的蛋白，洗脱缓冲液包括125mM三羟甲基氨基甲烷、750mM NaCl、300mM咪唑和0.02wt% NaN3，其中洗脱缓冲液的pH为 7.4 ;
[0023](26)、将洗脱下来的目的蛋白在蒸馏水中4°C透析过夜，再进行真空冷冻干燥，最后溶解于0.2M NaHCOjP 0.5M NaCl混合溶液中，混合溶液的pH为7.5?8.5。
[0024]进一步地，步骤(23)中滤膜的孔径为0.22mm。
[0025]作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案:步骤(3)包括以下步骤:
[0026](31)、将4ml NHS活化胶用4°C预冷的ImM HCl洗3?5次后抽干，再用0.2M NaHCO3和0.5M NaCl的混合溶液清洗2次，混合溶液的pH为7.5?8.5，抽干后将4ml NHS活化胶加入到1ml的离心管中；
[0027](32)、将40mg蛋白M溶液加入到步骤(31)装有4ml NHS活化胶的离心管中，反应温度恒定在室温，摇床中振荡混合，离心管水平放置，转速120rpm，反应5h过滤，收集沉淀；
[0028](33)、封闭离心管中未反应的NHS:将步骤(32)收集的沉淀加入到25ml磨口三角瓶中，加入9ml封闭液，封闭液为0.5mol/L乙醇胺和0.5M NaCl的混合液，混合液的pH为7.5?8.5，反应温度恒定在室温，搅拌速度120rpm，反应5h，将磨口三角瓶中物质转移到砂芯漏斗中，抽滤2min，用去离子水清洗砂芯漏斗中的固体产物；
[0029](34)、清洗，将步骤(33)制得的固体产物依次用5倍的去离子水、0.1M含0.5MNaCl的pH为4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、去离子水、0.1M含0.5M NaCl的pH为8.0硼酸-四硼酸钠缓冲液和去离子水重复交替清洗3次，抽干，去除未反应的配基得到蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF ;
[0030](35)、保存，制得的蛋白M偶联的琼脂糖凝胶4FF保存于4°C、20%乙醇溶液中。
[0031]作为本发明中一种蛋白亲和纯化IgY的方法的一种优选方案:步骤(4)包括以下步骤:
[0032](41)、将鸡蛋的卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用pH为7.4的PBS按照体积比卵黄:PBS = I:2进行稀释，4°C搅拌过夜，再通过0.22微米滤膜过滤得到过滤后的卵黄液；
[0033](42)、蛋白M琼脂糖凝胶装柱后，用PBS冲洗5?10个柱体积平衡柱；
[0034](43)、将步骤(41)过滤后的卵黄液上柱；
[0035](44)、用PBS再洗5?10个柱体积，直至基线趋于平缓；
[0036](45)、用洗脱缓冲液将