通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体的利记博彩app
【专利说明】通过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基 肼配体
[0001] 本申请是申请日为2008年5月29日，申请号为200880100879.X，发明名称为"通 过蜕皮素受体复合物调节外源性基因表达的手性二酰基肼配体"的申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及生物技术、基因工程和药物化学领域。在一个实施方案中，本发明涉及 基因表达的领域。在另一个实施方案中，本发明涉及天然和突变的核受体的二酰基肼配体 和手性二酰基肼配体以及它们在基于核受体的可诱导的基因表达系统中的用途，以及使用 这些配体和可诱导的基因表达系统在宿主细胞中调苄基因表达的方法。
[0003] 背景
[0004] 本文引用了各种出版物，其公开内容通过引用被全文并入。然而，本文任何参考文 献的引用不应被解释为承认该参考文献对于本申请是可以作为"现有技术"的。
[0005] 在基因工程领域，基因表达的精确控制是研宄、操作和控制发育和其他生理过程 的有价值的工具。基因表达是复杂的生物过程，其包括许多特异性蛋白-蛋白相互作用。为 了触发基因表达以便其产生蛋白合成第一阶段中必要的RNA，必须将转录激活子接近控制 基因转录的启动子。通常地，转录激活子自身与具有至少一个DNA结合结构域的蛋白缔合， 所述DNA结合结构域结合存在于基因启动子区域的DNA结合位点。因此，为了使基因表达 发生，包括DNA结合结构域和位于所述DNA结合结构域适当距离处的反式激活结构域的蛋 白必须被置于基因的启动子区域中正确的位置。
[0006] 传统的转基因方法利用细胞类型特异性的启动子来驱使设计的转基因的表达。先 将含有所述转基因的DNA构建体整合进宿主基因组。当被转录激活子触发时，转基因的表 达在所给细胞类型中发生。
[0007] 调控外源性基因在细胞中的表达的另一种方法是通过可诱导的启动子。使用这种 可诱导的启动子的例子包括PRl-a启动子、原核的抑制子-操纵子系统、免疫抑制性抑免蛋 白系统和更高级的真核转录激活系统例如类固醇激素受体系统，并描述如下。
[0008] 来自烟草的PRl-a启动子在病原体攻击之后全身获得性抵抗应答中被诱导。 PRl-a的用途可被限制，因为它经常对内源性物质和外部的因子例如病原体、UV-B辐射 和污染物产生应答。基于由热激、干扰素和重金属所诱导的启动子的基因调控系统已 被描述（Wurn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA55:5414-5418(1986);Arnheiter等，Cell 62:51-61(1990);Filmus等，NucleicAcidsResearch20:27550-27560 (1992))。然而，这 些系统由于它们对非靶基因的表达的作用而具有局限性。这些系统还是有漏洞的。
[0009] 原核的抑制子_操纵子系统使用细菌抑制子蛋白和它们所结合的独特的操纵子 DNA序列。来自大肠杆菌的四环素（"Tet"）和乳糖（"Lac"）抑制子-操纵子系统二者都 已被用在植物和动物中以控制基因表达。在Tet系统中，四环素结合至TetR抑制子蛋白， 导致构象变化，其将抑制子蛋白从操纵子释放出来，并因此允许转录发生。在Lac系统中， 乳糖操纵子响应于乳糖或合成的类似物例如异丙基-b_D-硫代半乳糖苷的存在而被激活。 不幸地，这种系统的使用受到配体即四环素和乳糖的不稳定化学性质、它们的毒性、它们的 天然存在或者诱导或抑制所需要的相对高水平的限制。由于相似原因，这种系统在动物中 的使用受到限制。
[0010] 免疫抑制分子例如FK506、雷帕霉素和环孢菌素A可结合至抑免蛋白FKBP12、亲环 蛋白等。使用此信息，已经设计了总体战略以简单地通过将FK506置于两种蛋白中的每种 上或者通过将FK506置于一种上并将环孢菌素A置于另外一种上，而将任何两种蛋白结合 在一起。然后可使用FK506(FK1012)的合成同二聚体或由FK506-环孢菌素（FKCsA)融合所 得的化合物来诱导这些分子的二聚化（Spencer等，Science262:1019-24(1993);Belshaw 等，ProcNatlAcadSciUSA93:4604-7 (1996))。融合至FKBP12 的Gal4DNA结合结构域 和融合至亲环蛋白和FKCsA化合物的VP16激活子结构域被用来显示异二聚化和报道基因 在含有Gal4结合位点的启动子的控制下的激活。不幸地，该系统包括可具有不需要的副作 用的免疫抑制剂，并因此限制它用于各种哺乳动物基因开关应用。
[0011] 还使用了更高级的真核转录激活系统例如类固醇激素受体系统。类固醇激素受体 是核受体超家族的成员，并在脊椎动物和无脊椎动物细胞中被发现。不幸地，为了调控基因 表达而激活所述受体的类固醇化合物特别地在植物和动物中的使用由于它们参与这些生 物体中许多其他天然生物途径而受到限制。为了克服这种困难，使用昆虫蜕皮素受体（EcR) 开发了一种替代系统。
[0012] 昆虫的生长、蜕皮和发育受到蜕皮素类固醇激素（蜕皮激素）和保幼激素调控 (Dhadialla等，Annu.Rev.Entomol. 43:545-569 (1998))。蜕皮素在昆虫体内的分子革巴至少 由蜕皮素受体（EcR)和超气门蛋白（USP)组成。EcR是特征为签名DNA和配体结合域和激活 结构域的核类固醇受体超家族的成员（Koelle等，Cell，67:59-77 (1991))。EcR受体对若干 类固醇化合物例如松留酮A和米乐留酮（muristeroneM进行应答。最近，描述了具有蜕皮 类固醇激动剂活性的非类固醇化合物，其包括由Rohm和Haas公司销往全世界的商业上可 得的杀虫剂虫酰肼（tebufenozide)和甲氧虫酰肼（methoxyfenozide)(参见W0 96/27673 和US5, 530, 028)。两种类似物在其他生物体内都具有出色的安全性概况。
[0013] 昆虫蜕皮素受体（EcR)与超气门蛋白（USP)即哺乳动物的类视黄醇X受体（RXR) 的昆虫同系物发生异二聚化作用，并结合蜕皮类固醇和蜕皮素受体应答元件，并激活对蜕 皮素应答的基因的转录。EcR/USP/配体复合物在昆虫的发育和繁殖中起重要作用。EcR有 五个组件式结构域，A/B(反式激活）、C(DNA结合，异二聚化）、D(铰链，异二聚化）、E(配体 结合，异二聚化和反式激活）和F(反式激活）结构域。当与其他蛋白融合时，这些结构域 中的一些例如A/B、C和E保持它们的功能。
[0014] 紧密地调控的可诱导的基因表达系统或"基因开关"对于各种应用是有用的，其中 所述应用例如基因疗法、细胞中蛋白的大规模生产、基于细胞的高通量筛选测定、功能性基 因组学和转基因植物和动物性状的调控。
[0015] 第一种型式的基于EcR的基因开关使用了黑腹果幡（Drosophilamelanogaster)EcR(DmEcR)和小家鼠（Musmusculus)RXR(MmRXR)，并且显示了这些受体在类固醇松 甾酮A存在下反式激活哺乳动物细胞系和转基因小鼠中的报道基因（Christopherson 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89:6314-6318(1992);No等，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 93:3346-3351 (1996))。随后，Suhr等，Proc.Natl.Acad.Sci. 95:7999-8004 (1998) 显示非类固醇蜕皮素激动剂虫酰肼通过家蚕（Bombyxmori)EcR(BmEcR)在不存在外源性异 二聚体配偶体的情况下诱导了哺乳动物细胞中报道基因的高水平的反式激活。
[0016]W0 97/38117和W0 99/58155公开了调节外源性基因表达的方法，其中包括外源 性基因和蜕皮素应答元件的DNA构建体被包括蜕皮素受体的第二DNA构建体所激活，其中 所述蜕皮素受体因此在配体的存在下，或者可选地在能够作为沉默配偶体起作用的受体 的存在下，结合至蜕皮素应答元件以诱导基因表达。所选的蜕皮素受体是从黑腹果蝇分离 的。通常，为了提供最佳的激活，这种系统需要沉默配偶体的存在，优选地为类视黄醇X受 体（RXR)。在哺乳动物细胞中，昆虫蜕皮素受体（EcR)与类视黄醇X受体（RXR)异二聚化， 并以配体依赖的方式来调控靶基因的表达。W0 99/02683公开，分离自家蚕的蜕皮素受体在 哺乳动物系统中是有功能的，而不需要外源性二聚体配偶体。
[0017]US6, 265, 173B1公开，受体的类固醇/甲状腺超家族的各成员可与黑腹果蝇超 气门受体（USP)或至少包括USP二聚化结构域的其片段相结合以用于基因表达系统。US 5, 880, 333公开了用在植物中的黑腹果蝇EcR和超气门（USP)异二聚体系统，在其中反式激 活结构域和DNA结合结构域被置于两种不同的杂交蛋白上。不幸地，这些基于USP的系统 在动物细胞中是组成性的，并因此对于调控报道基因表达是无效的。
[0018] 在这些情况的每种中，反式激活结构域和DNA结合结构域（或者作为W0 99/02683 中天然的EcR或者作为W0 97/38117中修饰的EcR)被并入单个分子中，而且另一个异二聚 体配偶体USP或RXR以它们的天然状态被使用。
[0019] 近来，据显示，基于蜕皮素受体的可诱导基因表达系统导致了在不存在配体的情 况下大大减少的背景活性和在有配体存在的情况下显著增加的背景活性，在其中所述基因 表达系统中通过将它们置于两种不同蛋白上而将反式激活和DNA结合结构域互相分离（参 见TO01/70816A1，以其整体通过引用并入本文）。与在申请W0 97/38117和W0 99/02683 中公开的两种系统相比，该双杂交系统是显著地改进的可诱导的基因表达调节系统。所述 双杂交系统利用一对相互作用蛋白的能力来将转录激活结构域带到相对于DNA结合结构 域更有利的位置，以致于当DNA结合结构域结合至基因上的DNA结合位点时，反式激活结构 域更有效地激活启动子（参加，例如，US5, 283, 173)。简单说，所述双杂交基因表达系统包 括两个基因表达盒；编码DNA结合结构域的第一个融合至核受体多肽，而且编码反式激活 结构域的第二个融合至不同的核受体多肽。在配体存在下，第一多肽与第二多肽的相互作 用有效地将DNA结合结构域束缚在反式激活结构域上。由于DNA结合和反式激活结构域位 于两个不同分子上，在不存在配体的情况下背景活性大大减少。
[0020] 当与类固醇配体例如松甾酮A( "PonA"）或米乐甾酮（"MurA"）相比时，双杂交 系统还提供对非类固醇配体例如二酰基肼增强的敏感性。那就是，当与类固醇比较时，非类 固醇配体在较低浓度下提供更高活性。另外，因为基于EcR基因开关的反式激活通常是细 胞系依赖性的，所以较容易为每种应用定制基因开关系统以获得最大的反式激活能力。此 外，双杂交系统避免一些由于RXR过表达的副作用，而所述过表达通常发生在将未被修饰 的RXR用作异二聚体受体的配偶体之时。在一个双杂交系统中，EcR或RXR的天然DNA结 合和反式激活结构域被消除，因此这些杂交分子具有更少的与存在于细胞中的其他类固醇 受体相互作用的机会，并导致减少的副作用。另外的基因开关系统包括描述在下面的那些， 其中每一种都通过引用被并入：US7, 091，038、TO2004078924、EP1266015、US20010044151、 US2002011086UUS2002011952UUS20040033600,US2004019786UUS20040235097,US2006002