用于稳健t细胞和抗体应答的pr13.5启动子的利记博彩app
【专利说明】用于稳健T细胞和抗体应答的PR13. 5启动子
[0001] 发明背景
[0002] MVA来源于安卡拉皮肤痘苗毒株（安卡拉尿囊绒膜痘苗（CVA)病毒），所述病毒在 Vaccination Institute, Ankara, Turkey保持许多年并且用作对人进行疫苗接种的基础。 然而，由于通常发生与痘苗病毒（VACV)相关联的严重接种后并发症，曾经多次试图产生更 加减毒、更安全的天花疫苗。
[0003] 在1960年至1974年期间，Prof. Anton Mayr通过在CEF细胞中连续传代570次 以上来成功地将CVA减毒（Mayr 等人，1975, Passage History:Abstammung，Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA. Infection 3:6-14)。作为作 为预天花疫苗的MVA的早期开发的一部分，在处于来自痘苗的不良反应的风险下的受试者 中，曾经使用MVA-517(对应于第517次传代）以及Lister Elstree(Stickl, 1974, Smallpox vaccination and its consequences:first experiences with the highly attenuated smallpox vaccine"MVA".Prev.Med. 3(1) :97_101;Stickl 和 Hochstein-Mintzel，1971，I ntracutaneous smallpox vaccination with a weak pathogenic vaccinia virus(〃MVA virus〃）.Munch Med Wochenschr. 113:1149-1153)来进行临床试验。1976 年，在德国，来 源于MVA-571种子储备（对应于第571次传代）的MVA作为两阶段肠胃外天花疫苗接 种程序中的初免疫苗（primer vaccine)加以注册。随后，MVA-572在大约120, 000名高 加索人个体中使用，大部分儿童在1与3岁之间，并且未报道了严重副作用，虽然许多受 试者处于具有与常规痘苗病毒相关联的并发症高风险的群体之中（Mayr等人，1978, The smallpox vaccination strain MVA:marker,genetic structure,experience gained with the parenteral vaccination and behaviour in organisms with a debilitated defence mechanism(作者翻译）.Zentralbl. Bacteriol. (B) 167:375-390)。MVA-572 作 为 ECACC V94012707 寄存于 European Collection of Animal Cell Cultures, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology andResearch, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP40JG,United Kingdom。
[0004] 因为许多传代用于将MVA减毒，所以取决于CEF细胞中的传代数目，存在许多不同 毒株或分离物。所有MVA毒株来源于Dr. Mayr并且大多数从在德国的天花根除程序期间 使用的MVA-572,或广泛用作兽医疫苗的MVA-575得到。MVA-575于2000年12月7日在 European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)以寄存编号 V0012〇7〇7 寄存。
[0005] 通过CVA在原代鸡胚胎成纤维细胞中的连续繁殖（超过570次传代），获得减毒的 CVA-病毒MVA(改良的安卡拉痘苗病毒）。MVA由Bavarian Nordic进一步传代并且被称为 MVA-BN。与祖CVA病毒相比，MVA以及MVA-BN缺少大约13% (来自六个主要和多个次要缺 失位点的26. 5kb)的基因组。这些缺失影响许多毒力和宿主范围基因，以及编码A型包涵体 蛋白（ATI)的基因和编码将成熟病毒粒子引导至A型包涵体中的结构蛋白质的基因的较大 片段。MVA-BN的样品于2000年8月30日以编号V00083008寄存于European Collection of Cell Cultures(ECACC)〇
[0006] MVA-BN可连接并且进入人细胞，其中病毒编码的基因非常有效地表达。然而，子 代病毒的组装和释放未发生。MVA-BN和衍生物的制剂已经施用至许多类型的动物，和超过 2000名人受试者，包括免疫缺陷个体。所有疫苗接种已经证明总体上安全并良好耐受的。
[0007] 来自许多不同出版物的认识是所有MVA毒株是相同的并且代表高度减毒、安全、 活病毒载体。然而，临床前测试显示与其它MVA毒株相比，MVA-BN展示极好的减毒和功效 (WO 02/42480)。如例如以编号V00083008寄存于ECACC的MVA变体毒株MVA-BN能够在体 外在鸡胚胎成纤维细胞（CEF)中繁殖性复制，但是不能够在人细胞中繁殖性复制，其中MVA 575或MVA 572可繁殖性复制。举例来说，MVA-BN在人角化细胞细胞系HaCaT、人胚胎肾细 胞系293、人骨骼骨肉瘤细胞系143B和人宫颈腺癌细胞系HeLa中不能繁殖性复制。此外， 在不能产生成熟B和T细胞并且因此严重免疫受损并对于复制病毒非常敏感的小鼠模型 中，MVA-BN毒株不能复制。MVA-BN毒株的额外或替代性质是在与DNA初免/痘苗病毒加强 方案相比时，能够在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中诱导至少基本上相同水平的免疫 力。
[0008] 术语"不能繁殖性复制"在本申请中如WO 02/42480和美国专利6, 761，893中所定 义来使用，所述文献通过引用并入本文。因此，此术语适用于使用美国专利6, 761，893中所 描述的测定在感染之后4天具有小于1的病毒扩增率的病毒，所述测定通过引用并入本文。 病毒的"扩增率"是从感染细胞产生的病毒（输出）与最初用于首先感染细胞的量（输入） 的比率。输出与输入之间的"1"的比率定义从感染细胞产生的病毒的量与最初用于感染细 胞的量相同的扩增状态。
[0009] 根据一个实施方案，MVA-BN或它的衍生物的特征是在与DNA初免/痘苗病毒加强 方案相比时，在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中诱导至少基本上相同水平的免疫力。 痘苗病毒被视为在与DNA初免/痘苗病毒加强方案相比时，在痘苗病毒初免/痘苗病毒加 强方案中诱导至少基本上相同水平的免疫力，只要在与DNA初免/痘苗病毒加强方案相比 时，在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中，如在W002/42480所公开的"测定1"和"测定 2"之一，优选地在两种测定中所测量的CTL应答至少基本上相同。更优选地，在与DNA初 免/痘苗病毒加强方案相比时，痘苗病毒初免/痘苗病毒加强施用之后的CTL应答在至少 一个测定中较高。最优选地，CTL应答在两种测定中较高。
[0010] WO 02/42480公开如何获得具有MVA-BN的性质的痘苗病毒。高度减毒MVA-BN病 毒可例如通过改良的安卡拉痘苗病毒（MVA)诸如MVA-572或MVA-575的进一步传代来获 得。
[0011] 总之，与其它MVA毒株相比，MVA-BN已被证明具有最高减毒特征并且甚至在严重 免疫受损动物中是安全的。
[0012] 虽然MVA在哺乳动物细胞中展现强烈减弱的复制，但是它的基因被有效 地转录，并且病毒复制的阻断是在病毒组装和释出（egress)水平上。（Sutter和 Moss， 1992,Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes.Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A 89:10847-10851 ;Carroll 和 Moss，1997, Host range and cytopathogenicity ofthe highly attenuated MVA strain of vaccinia virus:propagation and generation of recombinant viruses in a nonhuman mammalian cell line. Virology 238:198-211.)尽管它的高度减毒和减少的毒力，在临床前研究中， MVA-BN已被证明引起对于VACV和克隆至MVA基因组中的异源基因产物的体液和细胞免 疫应答（Harrer 等人，2005, Therapeutic Vaccination of HlV-1-infected patients on HAART with recombinant HIV-lnef-expressing MVA:safety, immunogenicity and influence on viral load during treatment interruption. Antiviral Therapy 10:285-300 ;Cosma 等人，2003, Therapeutic vaccination with MVA-HIV-lnef elicits Nefspecific T-helper cell responses in chronically HIV-linfected individuals. Vaccine 22(1):21-29 ;Di Nicola 等人，2003,Clinical protocol. Immunization of patients with malignant melanoma with autologous CD34(+)cell-derived dendritic cells transduced ex vivo with a recombinant replication-deficient vaccinia vector encoding the human tyrosinase gene:a phase I trial. Hum Gene Ther. 14(14):1347_1360;DiNicola 等人，2004，Boosting T cell-mediated immunity to tyrosinase by vaccinia virus-transduced, CD34(+)-derived dendritic cell vaccination:a phase I trial in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 10(16) : 5381-5390.)
[0013] MVA-BN和基于重组MVA-BN的疫苗可在无血清培养基中培养的CEF细胞中生成、传 代、产生并制造。已经表征用于临床前和临床开发的许多重组MVA-BN变体。在MVA-BN、病 毒载体骨架与各种基于重组MVA的疫苗之间未观察到减毒（在人细胞系中缺少复制）或安 全（临床前毒性或临床研究）方面的差异。
[0014] 诱导针对由VACV载体表达的外源基因产物的强的体液和细胞免疫应答受以下事 实阻碍：外源基因产物必须与VACV载体的所有超过150种抗原竞争来识别并诱导特定抗体 和T细胞。特定问题是阻止诱导针对外源基因产物的强的CD8T细胞应答的载体CD8T细胞 表位的免疫显性°(5111；[1：11等人，11111]111110(1〇111；[仙110601^0叉￥；[四1-8口6(^；[(30'1^ in a human trial of recombinant-modified vaccinia Ankara. J. Immunol. 175