用于产生具有原代人肝细胞表型的细胞的方法和组合物的利记博彩app
【专利说明】用于产生具有原代人肝细胞表型的细胞的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年8月31日提交的美国临时申请序列号61/696, 059和于2013 年2月6日提交的美国临时申请序列号61/761，588的优先权权益，这两个申请各自以引用 的方式整体并入本文。
[0003] 引言
[0004] 丙型肝炎病毒（HCV)是引起急性和慢性肝炎的黄病毒科家族的小型包膜的正链 RNA病毒。它可在受感染的个体中引起肝硬化、肝细胞癌和脂肪变性。HCV的9. 6kb基因组 由单个开放阅读框组成，所述开放阅读框编码在翻译同时和之后裂解的约3000个氨基酸 的多蛋白。若干研宄已经报告了支持HCV感染的人为因素（Li等（2009)Proc Natl Acad Sci USA 106:16410-16415 ;Reiss 等（2011)Cell Host Microbe 9:32-45)。相当数量的 这些因素在囊组织、或膜和脂质相关的基因中起作用。另一方面，还已知HCV蛋白例如通 过膜性网络的形成、先天免疫途径的调节以及脂质合成途径的诱导来诱导受感染细胞中 的转录变化（Blais 等（2010) J Proteome Res 9:912-923 ;Blais 等（2010) J Biol Chem 285:25602-25612;Joyce 等（2009)PLoS pathogens 5:e100 0291;Singaravelu 等（2010) Proteome Sci 8:5 ;Walters 等（2006)Virology Journal 3:37 ;Walters 等（2006)PL〇S pathogens 2:e59)〇
[0005] 次基因组全长复制子系统和JFH-1感染模型已经洞察HCV翻译和RNA复制、出入。 这些模型中的大多数是基于HuH-7或HuH-7来源的细胞。HuH-7 (或HuH-7来源的）细胞的 使用对于HCV的体外研宄来说具有许多益处。这些细胞是容易获得的、快速分裂的并且因 此允许进行大规模实验。然而，这些系统并不一定准确表现在天然体内HCV感染期间发生 的事件，因为肝细胞通常不分裂且是完全分化的。已尝试通过以下措施来规避这一问题：通 过将1-2%二甲基亚砜（DMS0, 一种极性质子惰性溶剂）添加到细胞培养基中实现细胞的生 长停滞（Sainz等（2006) J Virol 80:10253-10257)，从而使得诱导肝细胞特异性基因的表 达。
[0006] 新鲜分离的原代人肝细胞在逻辑上是研宄HCV感染性的更具带代表性的体外 模型。然而，这些细胞中所产生的病毒的量很低（通常小于1〇 3个RNA拷贝/ml)，并 且对于长期实验（多于几天）必须将这些细胞与其它细胞类型共同培养（Banaudha等 (2010) Hepatology, 51:1922-1932 ;Ploss 等 Proc. Natl. Acad. Sciences 2010 第 107 卷第 73141-3145期）。因此原代肝细胞不适合大规模病毒产生。
[0007] 在HuH-7或HuH-7来源的细胞中已经实现大约106至10 7个RNA拷贝/ml (约1个 病毒/细胞）的HCV病毒滴度。然而，这些病毒滴度通常太低以致于不能实现商业规模的 病毒颗粒产生。另外，HuH7. 5细胞中的感染仅利用非典型性HCV变体JFH-1才可能实现。
[0008] 本领域需要可以用作原代人肝细胞体外模型的培养系统。
[0009] 概述
[0010] 本公开提供涉及表现出原代人肝细胞表型的人肝细胞细胞系的体外培养物的方 法和组合物。这类细胞系易于被嗜肝病毒诸如HCV或HBV感染，并且支持病毒复制和高水 平的病毒颗粒产生。这类体外培养物可用于嗜肝病毒的产生和研宄，以及筛选（例如，抗病 毒药物、评估药物代谢）方法、和原代人肝细胞的研宄。
[0011] 本公开提供产生包含具有原代人肝细胞表型的细胞的细胞培养物的方法，所述方 法包括将人肝细胞癌（hHCC)细胞系在包含人血清的培养基中培养超过11天，其中所述培 养诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞。在一些实施方案中，所述培养基 包含约1 %至20 %的人血清，任选地约2 %至10 %的人血清。在一些实施方案中，所述hHCC 细胞系为HuH-7或HuH-7来源的细胞系。在一些实施方案中，所述培养并未在于包含人血 清的培养基中培养10天后进行传代培养。本公开进一步提供包含通过这类培养方法产生 的细胞的细胞培养物。
[0012] 本公开提供具有人原代肝细胞表型的细胞的细胞培养物，其中所述细胞是hHCC 细胞系的分化子代；以及包含人血清的培养基。在一些实施方案中，细胞培养物已被连续地 保持至少7天、至少8天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15 天、至少16天、至少17天、至少有18天、至少19天、至少20天、或至少21天或更久。在一 些实施方案中，所述培养基包含约1 %至20%的人血清，任选地约2%至10%的人血清。在 一些实施方案中，所述hHCC细胞系为HuH-7或HuH-7来源的细胞系。
[0013] 本公开提供用于评估候选试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的影响的方法，所 述方法包括使本公开的分化细胞培养物与候选试剂接触；以及测定所述候选试剂对具有人 原代肝细胞表型的细胞的表型的影响的存在与否。在一些实施方案中，测定是针对所述候 选试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的脂质代谢的影响。在其它实施方案中，测定是针 对所述候选试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的极低密度脂蛋白（VLDL)、低密度脂蛋白 (LDL)和/或高密度脂蛋白（HDL)分泌的影响。
[0014] 本公开提供用于评估具有人原代肝细胞表型的细胞的试剂代谢的方法，所述方法 包括使本公开的分化细胞培养物与试剂接触；以及测定所述试剂和/或所述试剂的代谢物 的存在与否。在一些实施方案中，所述试剂是药物。
[0015] 本公开提供用于评估试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的毒性的方法，所述方 法包括使本公开的分化细胞培养物与试剂接触；以及测定指示所述试剂对细胞的毒性的细 胞表型变化的存在与否。在一些实施方案中，所测定的表型是培养基中转氨酶的增加和/ 或细胞死亡标志物的测定。
[0016] 本公开提供产生病毒颗粒的方法，所述方法包括将包含人肝细胞癌（hHCC)细胞 系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育多于11天，其中所述孵育诱导hHCC细胞系 分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；将嗜肝病毒的基因组引入hHCC细胞系或具有原代 人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；以及将细胞培养物保持在适合产生病毒颗粒的条件 下。在一些实施方案中，所述病毒基因组是通过将感染性病毒颗粒添加到培养基中来引入 的。在一些实施方案中，所述感染性病毒颗粒是在所述培养的第1天添加的。在一些实施 方案中，所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到hHCC细胞系中。在这些方法的一些实施 方案中，所述方法包括将病毒颗粒从培养基中分离。
[0017] 本公开提供包含通过一种方法所产生的细胞的病毒感染的细胞培养物，所述方法 包括将包含人肝细胞癌（hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育多于11 天，其中所述培养诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；以及将嗜肝病毒 的基因组引入hHCC细胞系或具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中。
[0018] 本公开提供用于筛选候选试剂的抗病毒活性的方法，所述方法包括将包含人肝细 胞癌（hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育多于11天，其中所述孵育 诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；将嗜肝病毒基因组引入hHCC细胞 系或具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；使细胞培养物与候选抗病毒试剂接 触；将细胞培养物保持在适合病毒复制的条件下；以及检测候选试剂对病毒复制的影响存 在与否；其中相较于不存在候选试剂时在存在候选试剂时病毒颗粒产生的降低表明候选试 剂具有抗病毒活性。在一些实施方案中，所述病毒基因组是通过将感染性病毒颗粒添加到 培养基中来引入的。在一些实施方案中，所述感染性病毒颗粒是在所述培养的第1天添加 的。在一些实施方案中，所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到hHCC细胞系中。
[0019] 本公开提供用于筛选疑似含有抗体的样品的抗病毒活性的方法，所述方法包括将 包含人肝细胞癌（hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育多于11天，其 中所述孵育诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；将嗜肝病毒的基因组 引入hHCC细胞系或具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；使细胞培养物与疑似 含有抗体的样品接触；将细胞培养物保持在适合病毒复制的条件下；以及检测样品对病毒 复制的影响存在与否；其中相较于不存在样品时在存在样品时病毒颗粒产生的降低表明样 品含有具有抗病毒活性的抗体。在一些实施方案中，所述病毒基因组是通过将感染性病毒 颗粒添加到培养基中来引入的。在一些实施方案中，所述感染性病毒颗粒是在所述培养的 第1天添加的。在一些实施方案中，所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到hHCC细胞系 中。
[0020] 本公开提供用于针对脂蛋白介导的疾病的治疗筛选候选试剂的方法，所述方法包 括：将包含人肝细胞癌（hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育至少3 天、至少5天以及在一些实施方案中孵育至少14天，其中所述孵育诱导hHCC细胞系分化 成具有原代人肝细胞表型的细胞；使细胞培养物与候选试剂接触；以及针对候选试剂相较 于对照样品对分化的hHCC细胞系所分泌的脂蛋白的水平的影响的存在与否测定细胞培养 物；其中候选试剂对分化的hHCC细胞系所分泌的脂蛋白的水平的影响表明候选试剂可用 于治疗脂蛋白介导的疾病。在某些实施方案中，针对候选试剂相较于对照样品对培养基中 极低密度脂蛋白（VLDL)、低密度脂蛋白（LDL)和/或高密度脂蛋白（HDL)的水平的影响的 存在与否测定细胞培养物。在具体实施方案中，所述方法是用于针对动脉粥样硬化的治疗 筛选候选试剂，其中VLDL或LDL的降低或HDL的增加表明候选试剂可用于预防或治疗动脉 粥样硬化。
[0021] 本公开提供用于产生感染嗜肝微生物（例如，病毒）的培养肝细胞的方法，所述方 法包括使培养肝细胞与感染性嗜肝微生物在包含耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清的培养 基中接触，其中接触持续足以使培养肝细胞感染嗜肝微生物的时间。在一些实施方案中，所 述培养细胞是原代肝细胞或永生化肝细胞细胞系。在一些实施方案中，培养细胞是分化的 hHCC细胞。在一些实施方案中，耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清为耗尽LDL受体结合脂蛋 白的人血清或耗尽LDL受体结合脂蛋白的胎牛血清。在一些实施方案中，感染性嗜肝微生 物为嗜肝病毒。在一些实施方案中，嗜肝病毒为丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒。在一些实 施方案中，嗜肝病毒为临床分离株。
[0022] 在阅读了本说明书之后这些和其它特征将对于普通技术人员是明显的。
[0023] 附图简述
[0024]图1是示出培养条件的时间线的实施例的流程图。
[0025] 图2A-2B示出含胎牛血清（FBS)的培养基相对含人血清（HS)的培养基中的细胞 的外观和生长的差异。图2A是示出相比培养的人原代肝细胞（右图），在补充FBS(左图） 和HS (中图）的培养基中生长的细胞的一组照片。图2B是示出保持在含FBS的培养基（闭 合圆圈）相对含HS的培养基（空心圆圈）中的细胞培养物的细胞数目的图。
[0026] 图3A是示出在保持在FBS或HS (7天或21天）中的细胞、以及保持在原代肝细胞 培养基（PHM)中的HuH7. 5细胞和培养的人原代肝细胞（prim，h印.）中的肝细胞分化标志 物LDL受体、白蛋白和a 1-抗胰蛋白酶的表达的一组图。还包括密蛋白-l(claudin-l)和 紧蛋白（occludin)的表达，它们是在肝脏中高度表达的两种紧密连接蛋白
[0027] 图3B是示出关键脂质代谢调节剂（肝X受体a (LXR a )、过氧化物酶体增殖物活 化的受体a和y (PPARa、PPARy)，在HS中所培养的细胞中高度表达的一组图。在人血 清中生长的细胞中，细胞骨架蛋白波形蛋白和E-钙粘蛋白也增加。
[0028] 图4是示出相比？85和培养的原代肝细胞&1^111.11印.），对在2%01^0或2%成牛 血清（ABS)存在下生长的细胞上的上述分化标志物的影响的图。ABS和DMS0都诱导接触抑 制/生长停滞，但不会诱导分化标志物的表达增加
[0029] 图5A是示出相比FBS在HS中培养的细胞（右图）中细胞脂质小滴增加的一组照 片。
[0030] 图5B是示出对保持在FBS或HS中的细胞的Bodipy荧光的定量的图（n>4)。
[0031] 图6A-6E是示出用HCV菌株JFH-1 ( "JFH"）感染细胞的结果的一组图，其中细胞 是在FBS或HS中培养。图6A:在用产自人血清或胎牛血清中培养的细胞的JFH病毒感染 之后，FBS中培养的细胞的病毒滴度（JFH-HS，圆形JFH-FBS，正方形）。图6B :用相同病毒 (JFH-HS)感染的在不同条件（FBS，空心圆圈；HS，闭合圆圈）下生长的细胞的病毒滴度。图 6C示出FBS培养的细胞中的JFH-FBS相比HS培养的细胞中的JFH-HS的产生之间的病毒 滴度中的1000倍差异。图6D:在将细胞从含FBS的培养基中转移至含HS的培养基时感染 (空心圆圈）或在从含FBS的培养基中转移至含HS的培养基之后14天感染（闭合圆圈） 下的人血清中生长的细胞中的高病毒滴度的长期产生。图6E:示出在具有2% HS的原代肝 细胞培养基（PHM，2% HS)或具有2% HS的DMEM(DMEM，2% HS)中生长的细胞的病毒滴度。
[0032]图7是示出用HCV感染的患者血清（圆形）、通过电穿孔HuH7. 5细胞随后在含HS 的培养基中培养而产生的JFH病毒（JFH-HS，正方形）或组织培养的病毒HCVcc (三角形） 感染嵌合SCID/Alb-uPA小鼠模型的结果的图，
[0033] 图8是示出含人血清培养物对HCV的影响的一组图。图A :如通过蔗糖梯度离心 测定的产自于FBS(圆形）或人血清（正方形）中培养的细胞的病毒的病毒密度；图B:产 自于FBS或人血清（HS)中培养的细胞的病毒的病毒密度分布的定量；以及图C:不同病毒 变体的载脂蛋白B缔合。JFH FBS:产自于FBS中培养的细胞的JFH-1 ;JFH HS:产自于HS 中培养的细胞的JFH-1;患者血清。
[0034] 图9是示出向分化细胞添加含ApoB脂蛋白的影响的一组图。左图：向分化细胞添 加人VLDL对病毒产生的影响；右图：向分化细胞添加人LDL对病毒产生的影响。
[0035] 图10是示出用来自2位不同患者（患者1:圆形；患者2:正方开$，两者都是基因 型1A)的HCV阳性血清感染保持在人血清中的细胞的图。
[0036] 图11:图A和B是示出人血液（A)和来自于人血清（HS)中培养不同时间长度的 Huh7. 5细胞的培养基（B)的基于三酰基甘油的脂蛋白概况的图。使用尺寸排阻快速蛋白质 液相色谱法（FPLC)来进行脂蛋白分离。
[0037] 图12是示出取自于人血清（HS)中培养不同时间长度的Huh7. 5细胞的培养基的 基于胆固醇的脂蛋白概况的图。使用尺寸排阻快速蛋白质液相色谱法（FPLC)来进行脂蛋 白分离。
[0038] 图13是示出在感染于人血清（HS)中培养的Huh7. 5细胞之后的HBV产生的图。
[0039] 图14是在FBS或人血清中培养不同时间段的Huh7. 5细胞中NTCP表达的图。
[0040] 图15是示出比较在不同培养基（FBS、HS和肝素处理的FBS和HS (IfepHS和 IfepFBS))中HCV病毒产生的一组图。图A:HS(正方形）或FBS(圆形）中培养的细胞中的 病毒滴度。图B:HepFBS或H印HS中培养的细胞中的病毒滴度。图C:图B的前8天的放大 图。
[0041] 图16是示出使用肝素柱纯化HCV的图。通过定量每个级分中的HCV核心蛋白来 检测HCV。
[0042] 图17是示出使用利用肝素柱纯化的病毒感染FBS或H印HS中培养的细胞2天的 图像。
[0043] 图18提供示出用小鼠传代的HCV基因型la(图A)或用来自图A中星号（*)所指 示的时间点的细胞的上清液（图B)感染HS培养的Huh7. 5细胞的图。图B中的细胞在HS 中分化，放置于H印HS中2天，并且然后感染。
[0044] 图19和20示出HS培养的Huh7. 5细胞中阶段I代谢基因的基因表达分析。
[0045] 图21和22示出HS培养的Huh7. 5细胞中阶段II代谢基因的基因表达分析。
[0046] 实施方案详述
[0047] 在进一步描述本发明之前，应当理解本发明不仅限于所述的特定实施方案，因而， 当然也可有所变化。还应理解本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且无 意具有限制性，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
[0048]当提供值的范围时，应理解除非上下文另有明确规定，否则该范围的上下限和该 明示范围的任何其它明示或居中值之间的直到下限单位十分之一的每个居中值都涵盖于 本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在本发 明内，服从该规定范围内任何明确排除在外的界限。当所明示范围包括所述限值中的一个 或两个时，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包含于本发明中。
[0049] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域 中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在实践或测试本发明时也可以使用与本文 中描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的 所有出版物以引用的方式并入本文，以结合出版物所引用的内容来公开和描述方法和/或 材料。
[0050]应注意，除非上下文另有明确规定，否则本文中和所附权利要求中使用的单数形 式"一个"、"一种"和"所述"包括复数个指示物。因此，例如，提及"一个细胞"包括复数个 这类细胞并且提及"所述病毒"包括提及一种或多种病毒及其为本领域技术人员所知的等 效物等。
[0051] 本文论述的出版物仅因其公开内容在本申请的优先权日之前而提供。本文中的任 何内容都不应被解释为承认本发明无权通过以在先发明的方式从而先于这些出版物。此 外，所提供的公布日期可不同于可能需要独立确认的实际公布日期。
[0052] 提出实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公 开和描述，不意欲限制本发明人看待其发明的范围，也不意欲表示以下试验是进行的全部 或仅有的试验。已经努力确保使用的数值（例如用量、温度等）的准确性，但也应考虑一些 实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度 并且压力是大气压或接近大气压。
[0053] 应理解，出于清晰目的而在分开的实施方案的