水溶性的释放一氧化氮的聚葡糖胺和其用图
【专利说明】水溶性的释放一氧化氮的聚葡糖胺和其用途
[0001] 政府权益
[0002] 本发明是在政府支持下在美国国家卫生研宄院（The National Institutes of Health)授予的EB000708拨款下作出的。政府对本发明具有一定的权利。 发明领域
[0003] 本申请公开的主题提供释放一氧化氮的多糖和寡糖，特别是聚葡糖胺，以及它们 在生物医学和药学应用中的用途。更具体地，在一些实施方案中，本申请公开的主题提供释 放一氧化氮的寡糖，所述寡糖以受控和靶向方式释放一氧化氮，从而延长一氧化氮的疗效 和改善一氧化氮到靶细胞和/或组织的递送的特异性。
【背景技术】
[0004] 一氧化氮（NO)在生物学、生理学和病理生理学中的多方面作用的发现（参 见Marietta, M. A.等人，BioFactors, 2, 219-225 (1990))使人们寻找能够受控释放一 氧化氮的一氧化氮供体。参见Keefer, L.K.，Chemtech, 28, 30-35 (1998)。迄今为止， 研宄人员已经发现，NO调控心血管系统、胃肠系统、泌尿生殖系统、呼吸系统以及中枢 和周围神经系统中的一系列生物过程。参见Ignarro，L.J.，Nitric Oxide:Biology and Pathobiology ；Academic Press: San Diego, 2000 ； 以及 Ignarro, L. J.等人， Proc. Natl. Acad. Sci.，USA.，84, 9265-9269 (1987)。此外，NO 作为血管扩张剂的发 现以及其作为抗生素和杀肿瘤因子的确定使得NO成为有吸引力的药物候选者。参 见例如 Radomski，M.W.等人，Br.J. Pharmacol.，92, 639-646 (1987) ;Albina，J.E?和 Reichner，J.S. ;Canc.Metas. Rev. ,17,19-53(1998) ;Nablo，B.J.等人，J. Am. Chem. Soc.，123, 9712-9713 (2001) ;Cobbs，C.S.等人，Cancer Res. ,55, 727-730 (1995); Jenkins, D. C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA.，92, 4392-4396 (1995);以及 Thomsen, L. L.等人，Br. J. Cancer.，72, 41-44(1995) 〇
[0005] 已经报道几种一氧化氮供体，其中最著名的为N-二醇二氮烯鑰。通常， N-二醇二氮烯鑰NO供体是通过胺与NO在升高的压力下的反应合成的小分子，并且 已被用于例如在水溶液中自发地产生NO。参见Hrabie，J. A. *Keefer，L.K.，Chem. Rev. , 102, 1135-1154(2002) 〇
[0006] 探索一氧化氮供体例如杀死肿瘤细胞的活性的治疗策略尚有疑问，这部分地因为 本领域已知的一氧化氮递送系统任意释放或供给一氧化氮。因此，本领域需要以受控和/ 或靶向方式释放或供给一氧化氮的一氧化氮递送系统，以促进NO在生理学中的功能的改 善理解并为NO相关疗法的开发作准备。
【发明内容】
[0007] 在实施方案中，本文所公开的主题涉及含有共价结合的一氧化氮释放部分（即NO 供体）的聚葡糖胺。聚葡糖胺骨架中的至少一个结构单元含有式I的结构单元。任选地， 所述聚葡糖胺的至少一个结构单元还包含式II的结构单元。有利的是，本文所述的聚葡糖 胺是水溶性的，并且能够将NO递送到靶标。
[0008] 在实施方案中，本文所公开的主题涉及向个体递送或释放NO的方法，其包括给药 包含至少一个式I的结构单元并且任选地还包含至少一个式II的结构单元的聚葡糖胺。 [0009] 在实施方案中，本文所公开的主题涉及治疗个体的疾病状态的方法，其包括给药 包含至少一个式I的结构单元并且任选地还包含至少一个式II的结构单元的聚葡糖胺。
[0010] 在实施方案中，本文所公开的主题涉及药物组合物，其含有聚葡糖胺以及药学上 可接受的载体、赋形剂或稀释剂，所述聚葡糖胺包含至少一个式I的结构单元并且任选地 还包含至少一个式II的结构单元。
[0011] 在实施方案中，本文所公开的主题涉及制备包含至少一个式I的结构单元并且任 选地还包含至少一个式II的结构单元的聚葡糖胺的方法。
[0012] 在另一个实施方案中，本文所公开的主题涉及通过使用包含至少一个式I的结构 单元并且任选地还包含至少一个式II的结构单元的聚葡糖胺来破坏、消除或防止生物膜 的方法。
[0013] 在此处的附图和下文所述的说明书中全面地描述了该主题。
[0014] 附图简要说明
[0015] 图1描述了本申请公开的官能化的聚葡糖胺的有利性质。
[0016] 图2示出了在某些实施方案中发现的C、H和N的百分比。
[0017] 图3是某些实施方案的1H NMR。
[0018] 图4A描绘了某些壳寡糖CSO 2-N0在不同NO缀合溶剂中的释放曲线。甲醇：H20 7:3总共产生0. 87 y mol/mg的NO储存；图4B描绘了壳聚糖2/N0-5k在甲醇（实心正方 形）、甲醇/水9:1(实心圆圈）、甲醇/水8:2(空心三角形）、甲醇/水7:3(实心三角形） 和甲醇/水6:4v/v(空心正方形）中的一氧化氮释放曲线的特定数据点。
[0019] 图5A和5B描绘了（A)某些释放NO的壳寡糖的实时NO释放曲线；以及⑶某些 释放NO的壳寡糖的t [NO]对时间的曲线。
[0020] 图6示出了某些实施方案的t [NO]、[NO] _和t 1/2。
[0021] 图7描绘的数据显示释放NO的CSO导致具有生物膜的铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa) 5-log减少。释放NO的壳寡糖（实心符号）和对照壳寡糖（空心符号） (壳聚糖l_5k;CS0 1-N0(球形）、壳聚糖2-5k;CS0 2-N0(正方形）和壳聚糖3-5k;CS0 3-N0(三角形））对形成的铜绿假单胞菌生物膜的抗生物膜效力。对照壳寡糖未导致细菌活 力显著降低。
[0022] 图8A和8B描绘了在L929小鼠成纤维细胞中的细胞毒性。暴露于对照壳寡糖和 释放NO的壳寡糖的L929小鼠成纤维细胞的活力，所述壳寡糖在对于铜绿假单胞菌生物膜 实现5-log细菌活力降低的浓度（MBC)下。每个参数用多个平行测定进行分析（n = 3)。
[0023] 图9A-F描绘了 RITC标记的壳寡糖与生物膜中的铜绿假单胞菌缔合的共聚焦荧光 图像（A.壳聚糖2/N0-5k，B.壳聚糖3/N0-5k，C.壳聚糖2-10k)，以及用D)壳聚糖2/N0-5k、 E)壳聚糖3/N0-5k和F)壳聚糖2/N0-10k孵育的syto 9标记的生物膜的图像。syto 9的 绿色荧光表示嵌入生物膜中的铜绿假单胞菌。RITC的红色荧光表示RITC标记的壳寡糖与 在生物膜中的铜绿假单胞菌的缔合。比例尺：40ym。
[0024] 图10A-H描绘了与铜绿假单胞菌缔合的RITC改性的壳聚糖2/N0-5k在A) 24分 钟、B) 28分钟、C) 42分钟以及壳聚糖3/N0-5k在D) 82分钟、E) 86分钟、F) 110分钟、H) 120 分钟（150yg ml/1)与铜绿假单胞菌缔合的明视野和荧光图像。用G)壳聚糖2/N0-5k孵育 的铜绿假单胞菌在44分钟和用H)壳聚糖2/N0-5k孵育的铜绿假单胞菌在120分钟的叠加 图像。
【具体实施方式】
[0025] 本申请公开的释放一氧化氮（NO)的聚葡糖胺（在实施方案中也称为释放NO的壳 寡糖）有利地是水溶性的并且是可调接的。这些性质有助于本申请公开的聚葡糖胺在水 溶性治疗剂有利的治疗和疾病状态中，例如在囊性纤维化的治疗中的有效性。本申请公开 的官能化的释放NO的聚葡糖胺所具备的优于已知的NO释放颗粒的其他优点包括：1.通过 将含仲胺的低聚物链接枝到壳寡糖上的独特的合成途径和化学组成；2. NO储存和NO释放 动力学的可调接性是优点。通过调节在氮丙啶低聚物侧链上的仲胺的数量，可以控制NO储 存。不同疏水性/亲水性的化合物对所得物质上的胺的进一步官能化使得能够控制NO释 放动力学。事实上，用本申请公开的官能化的聚葡糖胺获得更大的NO储存；以及3.与颗粒 相比，本文所述的官能化的聚葡糖胺是水溶性的，从而有利于更广泛的应用，包括期望水溶 性的生物医学应用。此前公开的释放NO的壳聚糖（US 6451，337)不是水溶性的。这凸显 了另一个优点，即本申请公开的水溶性的官能化聚葡糖胺可以容易地透过和消除生物膜。
[0026] 本发明可以不同的形式体现，并且不应被解释为限于本文所述的实施方案。相反， 提供这些实施方案，以使本公开彻底且完全，并且将本发明的范围全面传达给本领域技术 人员。例如，对于一个实施方案说明的特征可纳入其他实施方案中，并且对于特定实施方案 说明的特征可从该实施方案删除。此外，鉴于本公开，对本文提出的实施方案的许多不背离 本发明的变化和增补对本领域技术人员会是显而易见的。
[0027] 除非另有定义，则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域 的一般技术人员所通常理解的含义相同的含义。在本文中用于本发明的描述的术语仅出于 描述特定实施方案的目的，并不意欲限制本发明。
[0028] 本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以其整体通过援引 加入本文。
[0029] 如本文所用，英文"a"、"an"或"the"可以指一个或多于一个。例如，NO释放部分 可以指单个或多个。
[0030] 也如本文所用，"和/或"是指包括相关所列项目中的一个或多个的任意和所有可 能的组合，以及当以替代方式（"或"）解释时不存在组合。
[0031] 此外，如本文所用，术语"约"当指代可测量的值，例如本发明的化合物或药剂的 量、剂量、时间、温度等时，意欲包括所指定的量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0. 5%或 甚至±0. 1 %的变化。
[0032] 术语"基本上由…组成"（和语法变体）当应用于本发明的组合物时是指该组合物 可以含有另外的组分，只要所述另外的组分不会本质上改变所述组合物。
[0033] 如本文所用，术语"治疗有效量"或"有效量"是指官能化的聚葡糖胺赋予患有病 症、疾病或疾患的个体调节效力的量，所述调节效力可以是例如有益的效果，包括改善个体 的病症（例如，一种或多种症状），延迟或减轻病症的进展，预防或延迟病症的发作和/或改 变临床参数、疾病或疾