猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒的诊断领域，具体涉及一种能同时检测猪蓝耳病病毒、高致病性 猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒的三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪瘟是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触 性热性传染病，该传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主，感染的病猪主要表现为 特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业造成重大的经济损失。病 猪是最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流 行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共 存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰最近爆发猪瘟也说明猪瘟流行形式发生了改变。猪 瘟新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV)和羊边界病毒（Border Disease Virus，BDV)同属黄病毒科 (Flaviviridae)瘟病毒属（pestivirus)。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA长约12. 3KB， 含有一个大的开放阅读框架。病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径 29-30nm，有囊膜。
[0003] 猪蓝耳病与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈 流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障 碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食，部分 患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出 生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是：眼球肿胀突出，头、臀部皮下水 月中，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏间质性肺炎病变。 1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的 来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发 病之前就已经存在。
[0004] 2006年我国南方部分省份出现养猪场（户）暴发猪"高热病"疫情，发病猪以"高 热"、"高发病率"和"高死亡率"为主要特征，给我国的养猪业造成了较大的经济损失。中国 动物疫病预防控制中心田克恭等研宄发现，猪"高热病"的主要致病病原为Nsp2缺失30个 氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异引起，后将其命名为"高致病性猪蓝耳病"（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV)，其致 病性大大增加，仔猪发病率可达100%、死亡率可达50%以上，母猪流产率可达30%以上， 育肥猪也可发病死亡。依据PRRSV结构基因序列的不同可以将其分为欧洲型和美洲型两种 基因型，而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型PRRSV分为经典株和高致病性株两 种亚型。
[0005] 常规的猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的实验室检验方法是根据免疫反应原理，利用 ELISA及双夹心ELISA法进行检测。目前，国内外已对猪瘟的结构蛋白基因进行了详尽的 研宄，国外有学者分别对CSFVAlfort株和BreSCia株基因进行了全序列测定，并通过免疫 学方法证明囊膜糖蛋白E1是CSFV诱导保护性中和抗体的重要抗原，而国内则对于石门株 (Shimen)的基因序列进行了测定。通过RT-PCR技术将编码相应结构蛋白的mRNA反转录 成cDNA，转入载体进行表达，并将表达产物进行纯化、定量以及作为抗原包板做ELISA进行 感染检测。另外猪瘟兔化弱毒EZ蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化后亦可以作为包被抗 原进行ELISA测定，但是由于不能区分自然感染的和免疫接种。PRRSV可以从各种临床样 品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、 脑、肝、翠丸、附翠、输精管、尿道球腺、阴茎组织、□咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、 粪便以及精液中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料。送检材 料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。但是只有当特定滴度的标准病毒在新巨 噬细胞生长良好，方可使用。冰冻切片免疫荧光抗体试验（IFA)以及免疫组化试验（IHC) 可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速，这两种方法的 特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA结果影响非常大，要求组织应该新 鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织 病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。另外，针对 上述两种病毒可以用RT-PCR技术进行检测。通常是用异硫氰酸肌一酚一仿一步抽提法提 取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对可疑的猪瘟或者猪蓝耳病病料进行 了 PCR扩增。如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于荧光抗体染色法、酶 标单克隆抗体染色法和电镜负染法，可以作为一种有效的诊断方法。概括来说猪瘟病毒和 猪蓝耳病病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主 要是检测血清中是否存猪瘟和猪蓝耳病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检 测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病 毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和 假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是 一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪蓝耳病病毒核酸，虽然灵敏度有 所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩 增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。
[0006] 荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时 监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便 快捷。CN101058830A公开了 "猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒"，CN101328506A公开 了"一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法"。两篇 文献均只对猪瘟病毒进行了单独检测。猪瘟和猪蓝耳病是严重危害猪的病毒性疾病，常以 单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前针对猪瘟病毒和猪蓝耳病病 毒感染的联合检测方法还未完善，而对高致病性猪蓝耳病毒的检测也仍然在探索阶段。目 前还没有能够同时对猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒进行同时检测的相 关试剂。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于针对上述不足提供一种具可同时用于猪蓝耳病病毒美洲型经 典株、高致病株和猪瘟病毒三种病毒的联合荧光定量检测。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0009] 猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒，其 包括以下检测引物和探针：
[0010] A、猪瘟病毒的特异性引物
[0011] 上游引物：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC
[0012] 下游引物：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG
[0013] 猪瘟病毒的特异性探针
[0014] 荧光探针：CY5-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ3
[0015] B、蓝耳病病毒美洲株的特异性引物
[0016] 上游引物：TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
[0017] 下游引物：GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
[0018] 蓝耳病病毒美洲株的特异性探针
[0019] 荧光探针：FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1
[0020] C、高致病蓝耳病病毒的特异性引物
[0021] 上游：TGTCCCCAAGCTGATGACAC
[0022] 下游：ATGGTGCTAAGGGGAAAGCC
[0023] 高致病蓝耳病病毒的特异性探针
[0024] 探针：HEX-CGTAGAACTGTGACA-MGB
[0025] 进一步，所述检测试剂盒还包括病毒总RNA萃取试剂、RT-QPCR混合酶液、RNase Free dH20、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
[0026] 其中，所述引物和探针包含于RT-QPCR反应液中，该反应液还包括Mg2+和dNTPs。 Mg 2+可以是常用的MgCl 2形式，浓度为0. 05M，dNTPs的浓度为0. 2M，引物和探针优选的浓度 为各0. 5M，缓冲液为TrisM针优选的浓缓冲液（0. 01M pH8. 0)。当然，也可以按照常规方式 将各试剂单独存放，在使用时进行配置，通常这种方式可以延长试剂的保存期限。然而，本 发明对引物和探针的选择，包括荧光试剂的选择已经对稳定性进行了优化，该混合反应液 能在低温下保存6个月。
[0027] 其中，所述病毒总RNA萃取试剂包括TRIZ0L试剂、氯仿/异戊醇和异丙醇。
[0028] 其中，所述RT-QPCR混合酶液包括RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶和Taq酶。
[0029] 其中，所述阳性对照包括猪蓝耳病病毒美洲株基因组RNA，高致病性猪蓝耳病病毒 基因组RNA和猪瘟病毒RAN。
[0030] 其中，所述阴性对照为空白缓冲液。
[0031] 本试剂盒基于三重RT荧光定量PCR技术，同时检测猪蓝耳病病毒分子，高致病猪 蓝耳病病毒分子和猪瘟病毒分子，用于动物肺、淋巴结、脾脏、肾、心、肝、血液及肉品等低微 含量样品的检测，诊断样品供体是否染毒，适用于活畜和肉品检疫。
[0032] 本发明试剂盒的特异性好、灵敏度高、三种常见猪病毒联合检测大大降低了检测 成本，节省了检测时间，能在疫情爆发时便于在短时间内确定疫病的种类。
【具体实施方式】
[0033] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0034] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0035] 实施例1弓丨物及探针的设计与筛选
[0036] 在RT-PCR检测中，引物及探针的设计直接影响到检测的特异性及灵敏性。尤其是 在多重RT-PCR检测中，不同引物及探针之间又存在着相互之间的影响。本发明在充分考虑 相关因素后，设计了若干组引物及探针，但不尽如意，然而意外发现以下引物及探针组显示 出良好的特异性及灵敏性。
[0037] 1?猪瘟病毒的特异性引物
[0038] 上游引物：TTCAATTTGGTTCAGGGCCTCC
[0039] 下游引物：TACTCAGGACTTAGACCACCCAGG
[0040] 猪瘟病毒的特异性探针
[0041] 荧光探针：CY5-ATGCCCATAGTAGGACTAGCAAACGG-BHQ3
[0042] 2.蓝耳病病毒美洲株的特异性引物