一种牛agpat6基因单核苷酸多态性的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因单核苷酸多态性的检测方法，特别涉及一种牛AGPAT6基因 单核苷酸多态性的检测方法。
【背景技术】
[0002] 单核甘酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms, SNPs)是指基因组 DNA 序列 中单个核苷酸（A/T/C/G)的变异，理论上包括转换、颠换、缺失和插入这4种不同的变异形 式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者发生的概率比约为2:1。其中转换是指 嘧啶与嘧啶之间或嘌呤与嘌呤之间的交换，而颠换是指嘧啶与嘌呤之间的交换。SNP在GC 序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，因为CG中的C常为甲基化的，自发脱氨后即成 为T。理论上，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后 两个很少见，几乎可以忽略，因此我们在检测基因的单核甘酸多态性的时候只考虑二等位 多态性即可。
[0003] 根据基因的单核苷酸多态性对蛋白氨基酸序列的影响进行分类，其包括同义突变 和非同义突变。同义突变是指SNP所致的碱基序列的变化不会导致其所翻译的蛋白氨基酸 序列的改变，这是由于同一个氨基酸可能有多个密码子，即密码子的简并性所导致的；值得 注意的是，虽然同义突变不会改变蛋白氨基酸序列，但是由于同一个氨基酸不同密码子所 对应的tRNA比例不一样，其还是会影响蛋白的表达量，进而影响个体的性状。而非同义突 变则是指碱基的变化导致所编码的氨基酸发生变化，从而使所翻译的蛋白改变，影响其功 能发挥，对个体的表型产生重要作用。相对于非同义突变，同义突变其实更为常见，因为一 种蛋白发生重大改变很可能使个体致死。
[0004] 目前，针对SNPs的检测主要有以下几种方法：DNA直接测序，单链构象多态技术 (SSCP)，以及PCR-RFLP技术等。其中，PCR-RFLP是一种新的有效的检测SNP的方法。其 首先通过混池测序找到SNP位点，在针对相应的SNP位点设计引物，再使用限制性内切酶 进行切割，最后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带分型即可准确的对SNP位点进行鉴别。 PCR-RFLP方法快速，简便，结果准确，费用低，很适合群体SNP的检测。
[0005] AGPAT又称为LPAAT，是甘油三酯（TG)合成过程中的关键酶。在TG的甘油三磷酸 (glycerol_3-phosphate，G3P)生物合成途径中，AGPAT催化LPA转变为PA，完成TGsn-2位 置的酰基化。同时，PA是合成多种甘油磷脂类的主要前体，例如PS，PE，PC，PI等，其中PS， PE，PC是形成各种细胞膜的主要磷脂，因此AGPAT活性变化所导致的LPA和PA比例的改变， 会影响细胞膜上磷脂的分布，并在细胞分裂时，影响膜的弯曲度。最新的研宄表明，AGPAT总 共有11中亚型，分别被不同的基因编码。在对小鼠的试验中发现，AGPAT1，AGPAT3在多种 组织中表达，而AGPAT2, AGPAT4, AGPAT5的表达具有组织特异性。AGPAT8, AGPAT 9, AGPAT 10, AGPAT 11则分别在不同组织中具有较高的表达量。
[0006] 对AGPAT6研宄发现，其主要在脂肪组织和乳腺上皮细胞中表达，只位于内质网， 缺乏AGPAT6的小鼠会厌食并避免遗传性肥胖，乳腺上皮细胞发育不良，奶中缺乏甘油二酯 和甘油三酯。最新的研宄表明，AGPAT6的氨基酸序列既与AGPAT家族相似，也类似于GPAT， AGPAT6具有GPAT活性，是一种GPAT微粒，因而又将其命名为GPAT4。而不管AGPAT家族 还是GPAT家族，都是合成甘油三酯的重要酶。本课题组的前期转录组学研宄结果也表明， AGPAT6基因可能与牛的肉质性状相关。因此，AGPAT6基因极有可能与中国西门塔尔牛的脂 代谢相关。动物从食物中获取能量，再在肝脏和脂肪等组织中把多余能量转变为脂肪储存 起来。动物脂肪过度沉积就会影响肉质和人类健康。所以，减少动物脂肪的过度沉积，阐明 其调控的分子机制及建立相应的调控技术已成为动物遗传学研宄的热点。因而，对AGPAT6 基因的研宄具有重要意义。目前，有关AGPAT6多态性的研宄主要是针对奶牛进行的。昝林 森等在荷斯坦奶牛AGPAT6基因第三内含子检测到2个SNP位点，其与产奶量和乳脂率密切 相关。张佳兰等在荷斯坦奶牛第二内含子发现1个SNP位点，其与产奶量、乳脂率和乳蛋白 率相关。但有关AGPAT6基因与肉牛性状的相关性目前还没有报道。
【发明内容】
[0007] 本发明解决的问题在于先利用PCR产物混合测序的方法筛查牛AGPAT6基因的多 态性位点，再通过限制性内切酶对单个样本PCR产物进行酶切检测，提供了一种快速，简 便，费用低的筛查和检测牛AGPAT6基因多态性的方法。通过AGPAT6基因SNP位点与牛性 状之间的相关性的分析，以功能SNP作为分子育种和辅助选择的标记，加快良种选育速度 和提尚种群品质。
[0008] 本发明的的技术方案如下：
[0009] 牛AGPAT6基因的单核苷酸多态性，其基因SNP包括：
[0010] 在牛AGPAT6基因第1外显子的303bp处有T>C的单核苷酸多态性；
[0011] 在牛AGPAT6基因第12外显子的299bp处有G>A的单核苷酸多态性。
[0012] 本发明提供的牛AGPAT6基因的单核苷酸多态性的检测方法，其步骤如下所述：
[0013] 第一步、用牛的全血进行全基因组DNA提取；
[0014] 第二步、以提取的全基因组DNA为模板，分别以引物对A、B为引物，PCR扩增牛 AGPAT6 基因；
[0015] 所述引物对A为：
[0016] 上游引物：5'TGGCAATGACAGACCTTCAGGAC 3'
[0017] 下游引物：5' CAGGAGGCTGACAATCAGGCTGT 3'
[0018] 所述引物对B为：
[0019] 上游引物：5'CACCTTGTGTCCCTTTCCGC 3'
[0020] 下游引物：5'AGAACAGCACTCCCCTAGCCCT 3'
[0021] 第三步、用PCR混合产物测序，找出SNP位点；
[0022] 第四步、用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；
[0023] 第五步、将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后根据电泳条带判定其多态性：
[0024]引物对A的PCR产物包含AGPAT6基因第1外显子的303bp处的T>C单核苷酸多 态性，酶切后，TT基因型个体表现为139bp，102bp，6 lbp和48bp条带，CC基因型个体表现为 163bp，139bp，61bp 和 48bp 条带，TC 基因型个体表现为 163bp，139bp，102bp，61bp 和 48bp 条带；
[0025] 引物对B的PCR产物包含AGPAT6基因第12外显子的299bp处的G>A单核苷酸多 态性，酶切后，66基因型个体表现为11%口和58(62外口条带44基因型个体表现为177匕口， 118bp 和 58(62)bp 条带。
[0026] 引物A、B的PCR扩增的反应程序均为：95°C预变性5min ;95°C变性30s，61°C退火 45s，72°C延伸45s，30个循环；延伸72°C lOmin，最后16°C保存。
[0027] 酶切产物琼脂糖凝胶电泳采用4%的琼脂糖凝胶。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 本发明利用PCR-RFLP技术对牛AGPAT6基因第1外显子的303bp处的T>C单核苷 酸多态性和第12外显子的299bp处的G>A单核苷酸多态性进行检测。
[0030] 本发明对牛群体的上述两个SNP进行了基因分型和基因频率分析，同时也将SNP 位点与牛的肉质性状和胴体性状进行了关联分析。
[0031] 本发明巧妙地利用PCR-RFLP法检测SNPs，发现了两个SNP位点与牛的肉质性状 和胴体性状之间的相关性。提供了一种低成本、简单、精准、便于推广应用的在DNA水平上 筛查和检测与牛肉质性状和胴体性状密切相关的遗传标记，可用于牛的辅助选择和分子育 种。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因引物对A的PCR产物2 %的 琼脂糖凝胶电泳图。
[0033] 图2为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因引物对B的PCR产物2 %的 琼脂糖凝胶电泳图。
[0034] 图3为本发明实施例中的中国西门塔尔牛AGPAT6基因第1外显子的303bp处T>C 位点的混池测序结果图。
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