大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的aflp指纹图谱构建的利记博彩app
【专利说明】大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建 【技术领域】
[0001] 本发明涉及大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建。 【【背景技术】】
[0002] 大豆疫霉菌（Phytophthorasojae)可引起大豆生产中危害极严重的大豆疫霉根 腐病，是中国对外公布的I类危险性检疫对象，也是内检对象。大豆疫病已成为我国大豆生 产上的突出问题，给我国的大豆生产带来严重的经济损失。
[0003] 大豆疫霉菌为土传真菌，但病菌寄生性强，不能在土壤颗粒上竞争生长和定殖，卵 抱子在植株病残体和土壤中能存活多年。大豆疫霉菌在利马豆、玉米粉、V8汁等培养基上生 长较快，菌落均匀，边缘整齐。菌丝宽3~9ym，易卷曲；菌丝体珊瑚状，分枝近直角，在分枝 基部稍绕缩，老熟后产生隔膜；菌丝可形成结节状、膨大体和厚垣抱子。孢囊梗简单，顶生游 动孢子囊；游动孢子囊倒梨形和椭圆形，无乳突；游动抱子卵圆形，一端或两端钝圆，侧面 平滑，有两根鞭毛。周肇惠等研究证实卵孢子只产生于带菌种子的种皮，检测大豆种皮存在 卵孢子与否可以作为大豆种子带菌检测方法之一。1957年，Bernard发现了大豆对大豆疫霉 菌存在抗性分化。1959年Hildebrand发现不同大豆疫霉菌分离物在毒力上有差异，认为大 豆疫霉菌存在生理株系。1965年Morgan和Hartwig首次报道了大豆疫霉菌的生理专化型， 描述为1号和2号小种。1963年育成了含有单抗性Rps-I的大豆商业品种，此后的十年间抗 病品种在美国北部地区广泛推广种植，大豆疫霉根腐病得到了基本控制。但正是由于这些 抗病品种的广泛应用，对病原菌造成相对高的选择压，加速了大豆疫霉菌的毒力分化。1972 年，schmitthenner在美国北部地区发现对当时推广的带有抗病基因的品种Harosoy63具 有毒力的分离物，并定名为3号小种，随后4~9号小种也相继在北部地区和加拿大被鉴 定。此后，在中国农业科学院硕士学位论文第一章引言抗病品种一小种互作下新的大豆疫 霉菌生理小种便不断，其变异速度远远高于从1号、2号小种到3号小种的变异。有研究认 为，在土壤中还可能存在更为丰富的生理小种多样性，由于田间种植品种的同质性较高，存 在于土壤中的许多小种尚不能通过田间发病植株的分离来进行检测。大豆疫霉菌是具有寄 主专化性的致病菌。已有的研究表明，大豆疫霉菌与大豆品种之间的互作具有基因对基因 的特征。在与寄主抗病性互作中，大豆疫霉菌毒力也在演变和快速进化，新的生理小种不断 出现，而且在大豆抗病性利用越多的地区，大豆疫霉菌的毒力变异就越快。至2000年，通过 在13个大豆疫霉菌生理小种鉴别寄主上接种鉴定，国际上已报道了 63个大豆疫霉菌生理 小种，许多研究者还报道了更多的毒力基因类型。事实上，一些研究者己直接从土壤中分离 鉴别出许多新生理小种。大豆疫霉菌分离物在实验室条件下，经过长时间的保存，也会在 致病毒性上发生变异，产生新生理小种。
[0004]目前，防治大豆疫病主要是通过选用抗病品种和使用化学药剂。使用抗病品种是 最经济，有效的防治途径。但是，目前培育的抗病品种大多为单基因控制的垂直抗性，生产 中缺乏有效的持久性抗病品种；同时大豆疫霉菌的变异常导致抗病品种抗性的丧失，而且 目前在商业上推广使用的农艺性状好的品种大多都是感病品种，这些因素的存在给大豆抗 病品种的培育和推广带来了困难。因此，化学药剂防治在大豆疫病的防治中占有重要地位。 目前大豆疫病已成为我国大豆生产上的突出问题，给我国的大豆生产带来严重的经济损 失。
[0005] 甲霜灵（Metalaxyl)属于苯酰胺类内吸杀菌剂，具有低毒、高效和持效期长等特 性，尤其对卵菌纲中的霜霉属、疫霉属和腐霉属的病原菌具有很强的活性。已被广泛应用于 包括大豆疫霉菌在内的卵菌所致植物病害的防治。但随着甲霜灵的普遍使用，病原菌的抗 药性问题接踵而来，病原菌的抗药性发展速度非常之快，使得病原菌对甲霜灵的抗药性问 题在同类杀菌剂中也显得最为突出。实验表明在甲霜灵的压力下，我国大豆疫霉菌在田间 可能产生抗性突变体，存在产生抗性群体的风险。到目前为止，已经有许多研究方法用于大 豆疫霉菌的检测鉴定，但现有的大豆疫霉菌检测技术存在许多不足之处，主要是检测的灵 敏度和准确性低，检测时间长，不适应检疫部门特别是口岸快速检测的要求，也无法通过建 立抗性监测体系来指导生产实践。
[0006] 迄今为止，植物病原真菌的分类鉴定主要依据其营养体和子实体的形态特征，大 豆疫霉菌也不例外。传统的大豆疫霉的检测方法是通过分离培养、显微镜观察形态及简单 的生理性状测定来实现。然而由于形态特征容易受到培养条件和其它因素的影响，而且许 多子实体类型经常难以获得，故给鉴定工作带来困难。大豆疫霉菌生长缓慢，以卵孢子存在 于土壤中，条件适宜时萌发产生游动孢子侵染大豆根系导致根部腐烂。由于患病部位经常 感染其它大豆根腐病菌和腐生菌，因此分离培养和纯化有一定难度，一般采用的病土中种 植感病的品种或用叶碟法诱捕土壤中的病菌游动孢子，然后用含有多种抗菌素的培养基从 发病的植株或叶碟中分离并纯化病原菌。上述方法虽然可以有效检测大豆疫霉菌，但所需 时间长、程序繁琐、灵敏度低。
[0007] 随着血清学技术和核酸技术的研究及应用，使真菌检测鉴定方法在快速、灵敏方 面有了更大发展。近年来，有关利用血清技术检测疫霉菌（包括大豆疫霉菌）的报道较多， 但血清学方法在实际应用时则有很多困难，主要是多克隆抗体抗血清效价不高、特异性不 强，很难达到实际应用水平；单克隆抗体又过于单一（可能是属级水平，也可能是种级水平 甚至生理小种级水平），在实际应用时可能会出现漏检现象，难于应用。 【
【发明内容】
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[0008] 本发明的目的是提供一种检测大豆疫霉菌变异的检测方法和技术。
[0009] 为实现上述目的，本发明提供了一种大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱 构建方法，、采用大豆疫霉菌对甲霜灵的抗药性稳定突变体，进行AFLP指纹图谱构建并获 得特异性条带；
[0010] 抗药性稳定突变体的筛选采用：甲霜灵驯化诱导，甲霜灵直接诱变和EMS化学诱 变，将获得的抗甲霜灵突变体进行稳定性分析并测定其对甲霜灵的抗性水平；
[0011]AFLP指纹图谱的构建包括下述步骤：利用优化体系引物组合构建诱导钱的野生 菌株和诱导后的抗性菌株不同引物组合的DNA指纹图谱，获得特异性条带。
[0012] 本发明提供的大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，其中，抗药性 稳定突变体的筛选方式为：
[0013] 甲霜灵驯化诱导：将供试菌株置于胡萝卜琼脂培养基（CA)上，25°C、黑暗培养 6-8d，然后移入含有0.lug/mL甲霜灵的CA平板上，8d后将在含甲霜灵平板上生长相对 较快的菌丝块转移至含有相同含量的甲霜灵平板上，以后每隔8d转1次，并逐渐增大甲霜 灵的含量，直至能在含10 Ug/mL甲霜灵的CA平板上生长，从而获得驯化抗性突变菌株；
[0014] 甲霜灵抗性突变株的直接诱导：将供试菌株置于CA平板上，25°C、黑暗培养6-8d， 然后移入含有甲霜灵〇. 1Ug/mL的CA上，每培养皿接种4块，每菌株接种10个培养皿， 接种后的培养皿用封口膜封口，置25°C黑暗培养，3d后每隔Id观察菌丝块生长情况。将各 菌株菌丝块边缘产生的快速生长角变区分别移至含甲霜灵〇.lug/mL的CA上，能较好生 长的菌株即可能为突变菌株，直至找到能在含10Ug/mL甲霜灵的CA平板上生长的抗性 菌株为止；
[0015] 甲霜灵抗性突变株的化学诱导采用甲基磺酸乙酯（EMS)化学诱变剂处理大豆疫 霉菌游动孢子悬浮液，然后涂布在含甲霜灵的CA培养基上，筛选抗性突变体。
[0016] 本发明提供的大豆疫霉菌对甲霜灵抗性的AFLP指纹图谱构建方法，其中，AFLP指 纹图谱的构建按如下步骤进行：
[0017] 1.提取抗性突变菌株DNA，制备高纯度DNA样品备用；
[0018] 1)酶切连接：反应体系 50iiL:DNA50ng，EcoRI12U，MseI10U，BSA1.g，NEB Buffer;加入 10iiL连接混合液：EcoRI接头 5pmol和MseI接头 50pmol，ATP10pmol，T4DNA 连接酶3U，充分混匀离心，分别37°C水浴6h;
[0019] 2)预扩和选扩：取5yL连接后的DNA样品，加入15yL预扩增混合液：EcoRI预扩 引物和MseI预扩引物各 75ng，lXPCRBuffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混匀后，94°C30s， 56°C30s，72°C60s，循环30个；取5iiL预扩增稀释产物，加入15iiL选择性扩增混合液： dNTP4nmol，引物混合液 0.5iiL，Taq酶 0.5U，1XPCRBuffer，混匀后，94°C30s，65°C30s， 72°C60s，12 个循环后变为：94°C30s，56°C30s，72°C60s，23 个循环；加入