一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法。
【背景技术】
[0002]n_3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，以下简称PUFAs)是细胞膜的重要组成部分，在人类很多疾病的预防和控制方面发挥重要作用。但是对哺乳动物来说，由于其体内缺少能够将n-6PUFAs转化为n-3PUFAs的脂肪酸脱氢酶，因此不能内源性合成，但是日益成熟的转基因技术使得生产出自身合成n-3PUFAs的转基因动物成为可能。但是转基因技术本身可能会给转基因动物带来一定的负面影响，例如，细胞衰老等。因此，如果要鉴定转入的外源基因对细胞衰老等方面的影响，必须排除转基因技术本身带来的影响。
[0003]含有两个或者或两个以上双键的脂肪酸通常被称为多不饱和脂肪酸(PUFA) ο脂肪酸是脂肪的重要组成成分。长链多不饱和脂肪酸通常分为η-3(ω-3)和η_6(ω_6)两类。这两类脂肪的代谢和功能不同，且往往具有相反的生理功能，往往是具有相反功能的信号分子的前体分子。众所周知，η-3多不饱和脂肪酸对人类健康是大有裨益的，它作为细胞膜的重要组成部分，可以抑制多种肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡。但是η-6多不饱和脂肪酸对细胞具有相反的作用，η-6多不饱和脂肪酸的过度摄入可以引起炎症和心血管疾病病。因此，提高η-3多不饱和脂肪酸的摄入量是非常重要的。研宄表明:饮
[0004]食中η-6和η-3多不饱和脂肪酸的的比值接近3: I或者4: I时，对健康有益。但是由于动物性食品的过多摄入及鱼油等的过低摄入导致目前饮食中η-6和η-3的比例过高。因为哺乳动物细胞缺乏自身合成η-3多不饱和脂肪酸和将η-6多不饱和脂肪酸转化为η-3多不饱和脂肪酸的酶，η-3多不饱和脂肪酸必须依靠膳食补充剂。
[0005]为了满足日益增长的人口对η-3多不饱和脂肪酸需求，必须发展一种可持续的η-3多不饱和脂肪酸资源。
【发明内容】
[0006]为解决上述问题，本发明提供了一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
[0008]一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法，包括如下步骤:
[0009]S1、根据GenBank中的的线虫序列(ACCESS1N NM_001028389)，采用化学合成法合成针对哺乳动物进行过密码子优化的FatI基因的编码区序列，并在起始密码子ATG之前加上了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表达的Kozak序列，并在其上下游分别引入了 Hindlll，KpnI限制性内切酶的酶切位点及相应的保护碱基；
[0010]S2、将步骤SI合成的序列连接到克隆载体PUC57载体中，获得重组质粒pUC57-FatI，将pUC57-FatI和真核表达载体pCDNA3.1(+)用限制性内切酶Hindlll，KpnI进行双酶切，胶回收相应的片段，将FatI基因连接入将连接入真核表达载体pCDNA3.1 (+)中获得重组质粒PCDNA3.1 W-FatI ;由于pCDNA3.1 (+) -FatI上具有2个SalI酶切位点，将经过质粒抽提获得的P⑶NA3.1 (+)-FatI用SalI酶切后胶回收相对大的片段，以备转染。
[0011]S3、取怀孕35天的波尔山羊，手术迅速取出山羊胎儿，用含双抗的PBS冲洗2遍，在超净工作台上将山羊胎儿去头去尾去内脏，剩下的部分用剪刀剪碎后加胰酶消化30min，用移液器吹打至大部分为单个细胞，将所得的细胞置于添加有10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/L硫酸链霉素的DMEM/F12培养基上，5% 0)2培养箱中37°C培养；
[0012]S4、当步骤S3中细胞汇合度达到85%左右时，用胰酶消化收集步骤S3所得的细胞，并用PBS冲洗2次，以彻底去掉胰酶，用无抗生素的细胞培养基稀释细胞，加入经过酶切回收的带有FatI基因的DNA，混合后冰浴lOmin，用电穿孔仪ECM830进行电转染；取出电击杯，冰浴1min后，将细胞转移至培养皿中在37°C，5% C02环境的培养箱中培养；细胞培养至24小时后加G418，进行抗性筛选；
[0013]S5、经过11天的培养筛选，培养皿中开始出现阳性克隆，将阳性克隆挑出后培养于96孔板中，然后逐级放大到24孔板和6孔板中，得到稳定表达促使细胞内η-6脂肪酸向η-3脂肪酸转化的FatI基因序列的细胞株；
[0014]S6、基因组PCR初步检测阳性细胞:对步骤S5培养过程中留在原培养板上的细胞继续培养，待细胞铺满培养板时用胰酶消化收集细胞，用基因组抽提试剂盒提取细胞的基因组，PCR初步检测外源基因是否进入细胞；琼脂糖凝胶电泳检测阳性的细胞株用于下一步实验。
[0015]S7、FatI的mRNA水平表达检测:基因组PCR检测为阳性的一个细胞株，利用EASYspinRNA快速抽提试剂盒进行RNA的提取，反转录后进行定量PCR检测细胞株中FatI的mRNA表达水平；
[0016]S8、脂肪酸组成分析AfFatI基因及pEGFP_Nl质粒的波尔山羊成纤维细胞克隆放大到10m细胞培养皿上后，添加10 μ mol/L的亚油酸和花生四烯酸进行培养，细胞完全长满后，用胰酶消化收集细胞；细胞用去离子水洗涤，加入2.5%H2S04/甲醇溶液lmL，80°C加热90min，冷却到室温后加入1.5mL 0.9% NaCl溶液和ImL正己烷，震动、低速离心将脂肪酸提取到有机相；吸取上层清液经液氮吹干后用于气相色谱(GC_MS)分析AfpEGFP-Nl的CHO细胞作为对照做相同处理。
[0017]S9、进行BrdU标记和检测:在细胞培养过程中加入1mM BrdU标记12小时后，用70%的乙醇固定，然后用PBS将残余的乙醇清洗干净，加入鼠源抗BrdU的抗体作为一抗，二抗用Cy3标记的抗鼠的IGg，奥林巴斯BX51焚光显微镜下拍照；
[0018]S10、TUNEL法检测细胞凋亡:在4°C条件下，用4%的多聚甲醛固定细胞25分钟后，加入焚光素标记的dUTP和末端转移酶37°C孵育一小时，然后分别用梓檬酸钠和PBS淋洗细胞，H0echst333258用来特异于细胞核着色，在荧光显微镜下能发绿色荧光细胞即为凋亡细胞，随机选取三板，每板上随机选择一个区域的至少1000个细胞进行计数，用凋亡细胞数除以细胞总数即为细胞凋亡率；
[0019]SI 1、细胞衰老检测:将细胞培养于24孔板，用PBS淋洗后，加入β -半乳糖苷酶试剂，室温孵育15分钟，PBS淋洗后加入ImL染色试剂，37°C孵育过夜，显微镜下拍照；
[0020]S12、进行数据统计，
[0021]所述步骤S4中电染所用的电击条件为:电压:600v，波长:400us。
[0022]所述步骤S6中RT-PCR初步检测外源基因所用引物为Fat1-F:5' -CAT GGT CGCTCA CTC CAG C-3'，FatI_R:5' -GGT ACC TTA CTT AGC TTT GGC CTT TTC-3';反应条件为:94°C 5min,94°C lmin,60°C 30sec,72°C Imin ；30 个循环，72°C 5min。
[0023]所述步骤S7中所用仪器为罗氏LC480，反应体系为10 μ L，包括I μ LcDNA，，5 μ Lof SYBR green master mix，0.2 μ L上游引物(20 μ M)，0.2 μ L下游引物(20 μ M)和 3.6 μ L灭菌去离子水；PCR条件为:95°C 10分钟，95°C 10秒，60°C 10秒，72°C 10秒，共45个循环。管家基因β-actin作为内参。实验结束后用2-(目的基因CT值-内参基因CT值)处理数据。
[0024]所述步骤S8中低速离心的速度为2000-3000r/min。
[0025]所述步骤S9用BrdU标记和检测试剂盒来检测细胞增殖。
[0026]所述步骤SlO用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端荧光标记凋亡检测系统进行凋亡细胞的检测。
[0027]所述步骤Sll利用β -半乳糖苷酶染色试剂盒进行细胞衰老的检测。
[0028]本发明实施例还提供了一种山羊的抗衰老基因的合成、转染及检测方法的应用:即将上述合成基因转入山羊成纤维细胞中，以期获得能自身