重金属强诱导启动子Cd-S4及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从植物中分离的启动子，尤其涉及从水稻中分离的镉镍等重金属 强诱导表达启动子，本发明还涉及含有该镉镍等重金属强诱导表达启动子的重组表达载体 以及在改良植物性状、培育植物新品种等方面的应用，属于植物组织或器官特异性表达启 动子的分离及其应用领域。
【背景技术】
[0002] 土壤不仅为植物的生长提供了支撑能力，还将水、肥、气等肥力要素提供给植物促 使其生长发育。近些年来，由于人口增长速度惊人，工业发展迅猛，农业化肥和农药的过度 使用等因素使土壤受污染的面积迅速扩大。因此，重金属污染已成为当今污染面积最广、危 害最大的环境问题之一。由于重金属污染毒理机制和生物效应的复杂性，对重金属污染的 研宄一直是国内外研宄的热点。
[0003] 镉镍等重金属是生物毒性较强和分布最广的重金属元素，是公认的对人类最具有 威胁的重金属元素。大量数据显示镉镍等重金属污染严重危害了农业生产和人类的健康。 随着生物科技的发展，研宄者采用了现代生物学手段，筛选出了对Cd、Ni、Pb等典型重金属 污染土壤具有良好修复效果的植物，如采用种植观赏花丼的方式，修复污染土地，避免了单 纯的植物修复工作，可以在治理环境污染的同时，带来显著的经济效益。也有学者提出，以 "边生产边修复"理念为出发点，建立一套基于植物多样性的既能保证农产品安全又能持续 修复镉镍等重金属污染土壤的间套种及轮作生产体系，如在重金属重度污染区域改种绿化 苗木或扫帚菜、棉花、席草等非食用经济作物；在中、轻度污染土壤上进行修复作物（如鸡 眼草、番茄、大豆等重金属高积累作物）与生产安全农产品作物（可食用部分重金属积累量 低的水稻、玉米等）的套种及轮作，从而挽回经济损失。
[0004] 现代基因工程技术为作物的定向改良和品种选育开辟了一条新途径。利用诱导性 启动子在特定环境下驱动目的基因的表达，在不影响正常发育的情况下达到作物改良的目 的，已日益受到人们的青睐。目前发现的镉镍等重金属特异性诱导的启动子并不多，因此， 人们要进行植物与重金属之间的作用研宄以及重金属治理方面的研宄时，能够选择的基因 资源有限。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种在镉镍等重金属条件下驱动外源基因在 水稻各个部位诱导表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。 本发明从水稻中分离克隆出镉镍等重金属强诱导表达启动子Cd-S4,为转基因水稻育种服 务，同时有利于提高转基因作物的安全性，并为长远的启动子改造和设计储备资源。
[0006] 具体而言，本发明提供一种水稻镉镍等重金属强诱导表达启动子，其特征在于，所 述启动子能够在镉镍等重金属诱导条件下调控目的基因集中表达。
[0007] 进一步地，所述水稻镉镍等重金属强诱导表达启动子包含：
[0008] (a)SEQIDNO: 1中所示的核苷酸序列；或者
[0009] (b)SEQIDNO: 2中所示的核苷酸序列；或者
[0010] (c)在SEQIDNO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列；或者
[0011] ⑷在SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列；或者
[0012] (e)与SEQIDNO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列；或 者
[0013] (f)与SEQIDNO: 2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列；或 者
[0014] (g)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列；或者
[0015] (h)在SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列；或者
[0016] (i)SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸 序列；或者
[0017] (j)SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸 序列；或者
[0018] (k)与带有SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的 对应核苷酸序列；或者
[0019] (1)与带有SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的 对应核苷酸序列。
[0020] 进一步地，所述启动子来自日本晴水稻，分离所采用的扩增引物包括第一引物和 第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQIDN0:3所示，所述第二引物的核苷酸序列如 SEQIDN0:4 所示。
[0021] 另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含所述的植物镉镍 等重金属强诱导表达启动子。
[0022] 另一方面，本发明提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含所 述的植物镉镍等重金属强诱导表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物镉镍等重金 属强诱导表达启动子连接于载体中待表达的基因序列的上游。
[0023] 进一步地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Cd S4,其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体。通过该载体获得相应的重组质粒（即重组表 达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水 稻的转化，得到转基因水稻植株。本发明对获得的转基因水稻进行GUS化学染色检测发现， 转基因植株经镉（Cd)诱导后，各个部位上呈现出明显的着色。且诱导后的Gus基因表达水 平是诱导前的41倍。对于水稻强启动子一一肌动蛋白启动子而言，在Cd未处理的情况下， 活性是CdS4启动子的31. 8倍，并且该启动子的活性不受Cd处理的影响。CdS4经Cd处 理后的活性达到肌动蛋白启动子的水平，说明CdS4是一个受镉诱导的强启动子。不仅如 此，其他的一些重金属，如镍（Ni)、铅（Pb)、砷（As)等，同样能诱导该启动子的活性。经诱 导后，Gus基因表达水平分别是诱导前的119倍、38倍和33倍。从而证明该2240bp的序列 具有重金属诱导活性。
[0024] 在所述重组表达载体中，所述待表达基因具有在镉镍等重金属强诱导下表达的功 能。
[0025]另一方面，本发明提供一种转化子，其特征在于，所述转化子包含所述的植物镉镍 等重金属强诱导表达启动子、所述的表达盒、或所述的重组表达载体。
[0026] 另一方面，本发明提供一种所述植物镉镍等重金属强诱导表达启动子在培育转基 因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述植物镉镍等重金属强诱导表达启动子 连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化 到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0027] 进一步地，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、 玉米、大麦、高粱或燕麦。
[0028] 换言之，本发明的发明人从日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)中分离 克隆Cd-S4基因上游包括转录起始位点在内的2240bp的DNA序列，并将其命名为Cd-S4 (序 列表中的SEQIDNo:1)。该启动子可以应用在单子叶植物中，例如水稻、小麦、玉米、大麦、 高粱或燕麦，优选为水稻。
[0029] 需要说明的是：SEQIDNo:1和SEQIDNo:2中的启动子均为本申请的发明 人获自日本晴水稻的启动子，只是SEQIDNo:1中的核苷酸包含了引物的留存部分，即 "TCTTITTCCTCCAGCACATGCA"和"CAGCTAGCGGCGCCGGCCGGCA"（后者与反向引物的相应序列 互补）。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除 上述引物留存序列后的DNA序列，其为启动子的主要部分。
[0030] 技术效果
[0031] 本发明发现并鉴定了特异性镉镍等重金属强诱导启动子，将其用于调控抗镉镍等 重金属诱导相关基因在植物中的表达，为耐镉镍等重金属植物品种的筛选和安全生产提供 参考，对培育耐镉镍等重金属诱导植物品种具有重要的意义。
[0032] 本发明所克隆的启动子Cd_S4能够调控基因在重金属诱导下在植株中表达。因 此，可以将其与所需的靶标基因连接，用于对各种单子叶植物进行外源基因在植株中表达 的调节和控制，对农作物或能源植物品种进行基因改造，从而使植物在重金属污染较严重 的土壤中生长，提高土壤的利用率。本成果适用于重金属污染区土壤污染的控制和土地再 利用，能够为金属冶炼尾矿废弃地、重金属污染区的生态治理提供方案和技术支持。
[0033] 本发明成果可以为受到重金属污染而无法利用的废弃土地创造出新的经济价值 提供技术支持，也可以提高典型重金属污染土壤的植物修复效果，为降低其环境危害提供 理论指导。
【附图说明】
[0034] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0035] 图1为将Cd-S4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中A为 PCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-CdS4示意图，其中示出了利用Cd-S4启动子驱动 位于其下游的Gus基因表达；
[0036] 图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
[0037] 图3为对获得的Cd-S4::gus转基因水稻植株，进行镉（100yMCdCl2)处理前后 的各部位⑶S染色结果示意图，图中上面部分表示的是镉（Cd)诱导前各组织染色结果，下 面表示镉（Cd)诱导后各组织染色结果，从左向右分别表示根、茎、叶组织（标尺=0.5cm)。
[0038] 图4为对获得的Cd-S4::gus转基因水稻植株，进行镉（100yMCdCl2)处理前后 Gus基因表达量的RT-PCR检测结果以及组成型启动子ACTIN进行相同实验的结果。图中以 镉（Cd)处理前转基因植株中的Gus基因表达量为1，结果显示，镉（Cd)处理后Cd-S4启动 子驱动的Gus基因表达量是处理前的41倍，超过水稻组成型启动子ACTIN的强度。
[0039]图5为Cd_S4启动子受镉（Cd)及其他重金属如镍（Ni)、铅（Pb)、砷（As)等的诱 导情况。
【具体实施方式】
[0040] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明