抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种双特异四价抗体，具体而言，本发明涉及同时靶向CD3和HER2的 抗体，更具体而言，本发明涉及抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体。
【背景技术】
[0002] -直以来乳腺癌都是一种致命性疾病，从首次发现转移到累积生存率为50%时所 对应的生存时间仅为 17 至 20 个月（Piccart MAnticancer Drugs, 7:5-7, 1996)。有一 些激素、细胞毒素或者其他生物制剂在乳腺癌的保守治疗中表现出一定的作用，但是截止 目前并没有一致认可的乳腺癌标准治疗方案，并且通常的治疗方案都会带来严重的副反应 (Bernard Marty C，等人，Oncologist, 9:617_632, 2004) 〇
[0003] 在二十世纪80年代，Denis Slamon首次在189个原发性乳腺癌病例中发现 HER2(人表皮生长因子受体2)基因在30 %的病例中都过度扩增，并表明HER2与总存活 率及复发时间密切相关（Salman DJ，等人，Science, 235:177-182, 1985)。目前的研宄 表明，大约25~30%的乳腺癌病人中的HER2都是过表达的（Revillion F，等人，Eur J Cancer, 34:791-808, 1998)，并且其与肿瘤的恶性生长程度相关（Wright C,等人，Cancer Res,49:2087-2090, 1989)〇
[0004] 曲妥珠单抗（Trastuzumab)是一个抗HER2胞外区的人源化单克隆抗体（Carter P,等人，PNAS, 89(10) :4285-4289, 1992)。然而其在临床应用中的抗肿瘤效果往往没 有临床前实验那么好，所以通常需要与化疗药等联合用药（Slamon DJ，等人，N Engl J Med, 344:783-792, 2001)。
[0005] 设计一种可以募集效应细胞的双功能抗体是提高抗体效能的有效手段。目前为 止，研宄最多的是利用⑶3分子的功能。通过⑶3分子将杀伤性T细胞激活，可以有效地清 除目的肿瘤（Haas C,等人，Immunobiology, 214:441-453, 2009)。其中 Micormet 公司开发 的一种重组双功能T细胞激动抗体为BiTE，具有很好的前景，但是其最大的问题在于血浆 半衰期非常短，人体半衰期仅为1小时（Loffler A，等人，Blood，95:2098-2103)。这是由 BiTE本身的结构所导致的，其由两个单链抗体片段组成，分子量仅60kDa，并且缺失了抗体 分子中对延长半衰期有重要作用的Fc片段。
[0006] 卡妥索单抗（Catumaxomab)是另一种具有前景的多功能抗体，是一种祀向⑶3及 EpCAM的杂合Ig分子，目前该产品已经被批准用于腹水癌的治疗（Jager M,等人，Cancer Res, 72:24-32, 2012)。另一种处于临床二期的多功能抗体为厄妥索单抗（Ertumaxomab)， 其靶向⑶3及HER2。这种杂合抗体的一条重链及轻链来源于大鼠的IgG，靶向⑶3 ;另一条 重链及轻链来源于小鼠的IgG，靶向HER2。由此而带来的问题就是这种产品的生产非常困 难，因为，为了获得表达双功能厄妥索抗体的细胞系，首先要获得一株表达CD3抗体的二倍 体杂交瘤，以及一株表达HER2抗体的二倍体杂交瘤，然后将两株杂交瘤再次杂交，获得四 倍体杂交瘤，其可以表达抗⑶3以及HER2的双功能抗体。而生产普通的单个靶点的抗体， 只需要获得一株二倍体杂交瘤，与此相比较，双功能抗体的生产过程更复杂，而且四倍体杂 交瘤的获得更加困难，并且由于其鼠源的来源，导致其免疫原性很高。
[0007] 因此，本领域需要一种人源化的并且能够高特异地靶向并杀死表达HER2的肿瘤 细胞，尤其是低表达HER2的肿瘤细胞的双功能抗体。
【发明内容】
[0008] 因此，本发明的技术目的在于提供利用CD3分子募集效应细胞的活性从而增强 HER2特异性杀伤肿瘤细胞活性的双功能抗体。
[0009] 因此，本发明的第一方面涉及一种双特异四价抗体，其包括一种靶向第一抗原 HER2的蛋白功能区和一种靶向第二抗原CD3的蛋白功能区，其中靶向第二抗原CD3的蛋白 功能区连接在靶向第一抗原HER2的蛋白功能区的C端。
[0010] 在某些实施方案中，所述靶向第二抗原CD3的蛋白功能区通过连接片段连接在靶 向第一抗原HER2的蛋白功能区的C端。
[0011] 在某些实施方案中，所述靶向第一抗原HER2的蛋白功能区为靶向HER2的免疫球 蛋白或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，在某些实施方案中，靶向第一抗原HER2的 免疫球蛋白为IgG、IgA、IgD、IgE、IgM抗体或者它们的杂合体，在某些实施方案中，靶向第 一抗原HER2的免疫球蛋白为IgG抗体。
[0012] 在某些实施方案中，所述免疫球蛋白为嵌合的、人源化的或全人的免疫球蛋白。
[0013] 在某些实施方案中，靶向第二抗原CD3的蛋白功能区为靶向CD3的免疫球蛋白或 其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，在某些实施方案中，靶向第二抗原CD3的蛋白功 能区为革巴向⑶3的scFv或Fab。
[0014] 在某些实施方案中，所述scFv或Fab为嵌合的、人源化的或全人的scFv或Fab。
[0015] 在某些实施方案中，所述连接片段长度为5-30个氨基酸，在某些实施方案 中，所述连接片段长度为15个氨基酸，在某些实施方案中，所述连接片段的序列为 GGGGSGGGGSGGGGS〇
[0016] 在某些实施方案中，所述双特异四价抗体由抗HER2 IgG-连接片段-抗⑶3 scFv 组成，在某些实施方案中，所述双特异四价抗体由两条包含SEQ ID No :1的轻链和两条包含 SEQ ID No :3的重链组成。
[0017] 在某些实施方案中，所述轻链和重链分别为经取代、缺失或添加一个或多个氨基 酸而由SEQ ID No :1和SEQ ID No :3衍生而来并高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细 胞的序列，或者是与SEQ ID No :1和No :3所示的序列具有至少约70%同一性并高特异地靶 向并杀死表达HER2的恶性细胞的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述轻链和重链分别为 与 SEQ ID No:l 和 No:3 所示的序列具有至少约 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%同一性 并高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的氨基酸序列。
[0018] 本发明第二方面涉及如上所述的双特异四价抗体的编码核酸序列。
[0019] 在某些实施方案中，所述编码核酸序列为分别包含SEQ ID No :2和No :4所示序列 的序列。
[0020] 本发明的第三方面涉及一种包含有效连接其中的如上所述的编码核酸序列的载 体。
[0021] 在某些实施方案中，所述载体中编码轻链和重链的核酸序列存在于不同的表达框 中。
[0022] 在某些实施方案中，所述的载体为真核细胞表达载体，在某些实施方案中，所述的 载体为经改造而具有两个表达框的载体Y0GC。
[0023] 本发明的第四方面涉及一种转化或转染有如上所述的载体的宿主细胞。
[0024] 本发明的第五方面涉及一种药物组合物，其包含如上所述的双特异四价抗体和药 学上可接受的载体。
[0025] 本发明的第六方面涉及一种生产双特异四价抗体的方法，其包括在适宜的多肽表 达条件下培养如上所述的宿主细胞，并从细胞培养基中分离、纯化表达的双特异四价抗体。
[0026] 本发明的第七方面涉及如上所述的双特异四价抗体在制备用于预防或治疗由 HER2表达而引起的疾病的药物中的用途，在某些实施方案中，所述疾病为恶性肿瘤，在某些 实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、胃癌、直肠癌，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选 自乳腺癌。
[0027] 本发明的第八方面涉及一种抑制或治疗恶性肿瘤的方法，包含给予治疗有效剂量 的如上所述的药物组合物，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、胃癌、直肠癌，在 某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌。
[0028] 本发明的第九方面涉及如上所述的双特异四价抗体，其用于预防或治疗由HER2 表达而引起的疾病，在某些实施方案中，所述疾病为恶性肿瘤，在某些实施方案中，所述恶 性肿瘤选自乳腺癌、胃癌、直肠癌，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌。
[0029] 本发明具有以下几方面优点：
[0030] (1)本发明的抗HER2-抗⑶3 scFv双特异四价抗体的结构示意图如图IA图所示。 这种抗体的结构具有两个与HER2抗原结合的区域①②，以及两个与CD3抗原结合的区域 ③