gp130胞外段蛋白及其生产方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明主要是属于肿瘤免疫学领域，具体涉及gpl30胞外段蛋白及其生产方法和 应用，特别是gpl30胞外段蛋白作为制备抑制肿瘤细胞增殖，防治肝癌病药物的应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌是我国常见恶性肿瘤之一。死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道 而居第三位，在医学界被称为"癌王"，发生率高，治疗很困难。目前虽然有各种治疗肝癌病 的药物，但大多效果不佳，不能满足人们对健康的需要，因此寻找一种能较好治疗肝癌病的 药物是医药学界面临的一项紧迫任务。
[0003] IL-6由包括肿瘤细胞在内的多种细胞分泌，参与肿瘤细胞的分化和增殖。经研宄 发现，IL-6及其受体IL-6R在许多的肿瘤中呈现高表达，与肿瘤患者预后不良有密切的关 系。IL-6 - STAT3信号通路是调控肿瘤细胞生存、凋亡以及耐药性最主要的信号通路之一。 因此，阻断IL-6 - STAT3信号通路可能成为治疗高水平IL-6,从而治疗肝癌的重要思路。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种能与肿瘤细胞表面膜型gpl30蛋白竞争性结合IL-6/ IL-6R分子复合物，阻断IL-6-STAT3信号通路，从而抑制肿瘤细胞生长、防治肝癌的gpl30 胞外段蛋白。
[0005] 本发明提供的gpl30胞外段蛋白，是由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋 白（我们又将其称为soluble gpl30,简称sgpl30)〇
[0006] 本发明的另一目的是提供编码所述蛋白的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示，以及含有该DNA序列的载体和含有该载体的宿主细胞。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种成本低廉，效果显著地生产所述蛋白的方法。
[0008] 它包括如下步骤：在G418浓度为200_900ul/ml的条件下，培养所述的宿主细胞， 从而表达及分离出所述的gpl30胞外段蛋白。
[0009] 本发明的再一目的是提供所述蛋白在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物以及防治肝 癌药物中的应用。
[0010] 所述肿瘤细胞是IL-6和IL-6Ra阳性的肿瘤细胞。更优选地，所述IL-6和 IL-6Ra阳性的肿瘤细胞选自人肝癌细胞。
[0011] 该胞外段蛋白是能与IL-6/IL-6R复合物特异性结合的配体，可以用人工合成方 法直接合成，也可以将蛋白的编码基因插入到表达载体，然后转染宿主细胞，用基因工程方 法生产。
[0012] 上述药物可包括一种或多种药学上可接受的载体。
[0013] 上述载体可以是稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表 面活性剂、吸附载体和/或润滑剂。
[0014] 上述药物均可按照药学领域的常规方法制备出以下剂型：注射液和冻干粉针。
[0015] IL-6 - STAT3信号通路是调控肿瘤细胞生存、凋亡以及耐药性最主要的信号通路 之一。当存在高水平的IL-6时，信号通路持续激活，使得胞内抗凋亡基因转录活性持续增 高，使得肿瘤细胞规避凋亡程序。实验证实：本发明的gpl30胞外段蛋白能够与膜结合型的 gpl30竞争性结合IL-6/IL-6R复合物，阻断IL-6 - STAT3信号通路，从而对肿瘤细胞的生 长产生影响，达到防治肝癌的作用。
[0016] 本发明的gpl30胞外段蛋白以gpl30分子为参考模板制作，能够抑制肿瘤细胞的 生长，防治癌症，同时对免疫系统的细胞影响较小。由于本发明的蛋白序列是人来源的，和 小鼠的序列几近一致，因此极少引起机体的免疫反应。使用肿瘤细胞进行增殖试验，雄性KM 小鼠进行肝癌防治试验，此蛋白能够实现和IL-6或者IL-6R单抗相似的作用，同时也避免 了抗体分子的副作用。本发明的蛋白可采用现有的常规方法制备，技术成熟。这些都是本 发明相对于现有技术的有益技术效果。
【附图说明】
[0017] 图1，真核重组表达载体pcDNA3. I_sgpl30的构建。
[0018] 图1中A为sgpl30蛋白基因序列PCR扩增； 图1中B为重组真核表达质粒pcDNA3. I_sgpl30的PCR验证； 图1中C为重组真核表达质粒pcDNA3. I_sgpl30双酶切验证。其中A:重组质粒 pcDNA3. I_sgpl30 未酶切；B :重组质粒 pcDNA3. I_sgpl30 双酶切。
[0019] 图2, gpl30胞外段蛋白表达、纯化及鉴定。
[0020] 图2中A为SDS-page初步检测蛋白的表达； 图2中B为Western Blot进一步检测蛋白的表达； 图2中C为SDS-page检测镍柱纯化的目的蛋白。
[0021] 图3, sgpl30蛋白活性鉴定。
[0022] 图3中A为不同浓度的sgp 130对!fepG2细胞生长的抑制率； 图3中B为sgpl30蛋白诱导H印G2细胞的凋亡。其中A-I :对照组细胞PI染色；A-2 : 对照组细胞Annexin V染色；B-I :sgpl30处理组细胞PI染色；B-2 :sgpl30处理组细胞 Annexin V 染色。
[0023] 图4, sgpl30蛋白活性鉴定。
[0024] 图4中A为采用免疫组化，检测甲胎蛋白（AFP); 图4中B为采用免疫组化，检测IY型胶原蛋白。
【具体实施方式】
[0025] -、获取 sgpl30 基因 以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目 的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0026] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 实施例所用仪器如下：二氧化碳细胞培养箱购自美国NUAIRE NU-5500E，移液器 购自美国Eppendorf公司，高速冷冻离心机购自德国Hermle公司，镍柱购自纯泰公司，立 式压力蒸汽灭菌锅购自上海讯音商贸有限公司，生物安全柜购自上海力申科学仪器有限公 司，切片机购自英国SHANDON公司，而生物显微镜购自奥利巴斯光学工业株式会社。
[0028] 实施例，本发明蛋白的制备及其功能检测 一、蛋白的表达和纯化 1、选择蛋白的片段序列 使用Expasy网站的Smart工具进行结构预测，并结合NCBI上的蛋白质结构分析， gpl30蛋白质第1-619个氨基酸为胞外段，第620-641为跨膜段，第651-659为胞浆段。因 此，我们选择第1-619位氨基酸残基处截取胞外段。
[0029] 2、载体构建及标签选择 以人!fepG2细胞的cDNA为模板，用引物(正向引物：5' -CCCAAGCTTGCCACC ATGGGGAAATATCCGCGCAAG-3' 和反向引物：5' -CGGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGAA CAGGCACGACTATGG-3'）将gpl30分子的第Iaa至第619aa的片段的编码DNA序列进 行扩增，通过引物加入6His的组氨酸标签，构建到真核表达载体pcDNA3. 1上，经过转染宿 主细胞L929,检测培养基上清中sgpl30蛋白的表达情况，发现成功表达带有6xHis标签的 sgpl30 蛋白。
[0030] 3、目的蛋白的鉴定及纯化 宿主细胞培养基上清进行SDS-page电泳（图2A)，再进行Western Blot鉴定（图2B)。 将细胞培养基上清通过Ni柱纯化，并进行SDS-page电泳验证（图2C)。
[0031] 二、蛋白的功能检测 实验材料：HepG2细胞(人肝癌细胞）源自实验室保存。1640培养基干粉购自 Hyclone，小牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，青霉素-链霉素购自Hyclone， 胰蛋白酶（Tripsin)购自华美生物工程有限公司，细胞增殖及毒性检测（MTT)试剂盒、 Annexin V -FITC凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，。
[0032] 实验仪器：二氧化碳细胞培养箱购自美国NUAIRE NU-5500E，pH计购自梅特勒-托 利多仪器(上海）有限公司，高速冷冻离心机购自德国Hermle公司，镍柱购自纯泰公司，立 式压力蒸汽灭菌锅购自上海讯音商贸有限公司，生物安全柜购自上海力申科学仪器有限公 司，切片机购自英国SHANDON公司， 而生物显微镜购自奥利巴斯光学工业株式会社。 1、sgpl30蛋白对肿瘤细胞增殖的抑制作用 (1)细胞增殖及毒性检测（MTT)实验 实验组的设置：本底组：加入培养基，MTT试剂，DMSO (未加入蛋白、细胞）；对照组：加 入细胞，培养基，MTT试剂，DMSO (未加入蛋白）;实验组：不同sgpl30终浓度（ug/ml):l. 14、 0.57,0.285,0. 1425,0. 07125 ； 1)在96孔板加入细胞IOOul/孔(约1X104)，置于37°C 5%C02细胞培养箱24小时。
[0033] 2)加入适当浓度的受试化合物。
[0034] 3)将96孔板在37°C，含5%C02空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。
[0035] 4)将 5XMTT 用 Dilution Buffer 稀释成 1XMTT。
[0036] 5)每孔加50ul 1XMTT，在37°C孵育4小时，使MTT还原为甲臢。
[0037] 6)吸出上清液，每孔