牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物检验检疫领域，具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测引物、试剂盒及检测方法，尤其适合基层临床兽医使用。
【背景技术】
[0002]近年来，随着奶牛养殖数量的增加和养殖密度的增大，牛传染性鼻气管炎(Infect1us Bovine Rhinotracheitis, IBR)的发病日益增多。IBR 是牛的一种急性、热性、接触性传染病，被世界动物卫生组织列为B类动物传染病，该病由牛传染性鼻气管炎病毒(Infect1us Bovine Rhinotracheitis virus, IBRv)引起，病牛临床表现为上呼吸道及气管粘膜发炎、呼吸困难、流鼻液、生殖道感染、流产、乳房炎和脑膜炎等。报道显示我国多数地区均有IBR阳性病例检出的报道，给我国奶牛业造成严重危害和损失。
[0003]同时，我国还规定，进出口牛及其肉制品必须检测IBRv，也促使其检测方法迅速发展，目前，已经研究开发了多种诊断方法，主要有病原学方法和血清学方法。血清学方法主要包括血清中和试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，可用于IBRv抗体检测，但往往操作繁琐，且无法检测病原，对体内潜伏感染检测困难。病原学检测技术主要包括病毒分离鉴定、核酸检测(PCR、qPCR和核酸探针技术)，尽管该方法可以对病毒直接进行检测，但是往往需要的一定的实验设备和技术要求，在兽医临床基层实验室推广有一定限制。
【发明内容】
[0004]针对上述问题，本发明采用环介导等温扩增技术(LAMP)，提供了一种特异性好的牛传染性鼻气管炎病毒检测引物、试剂盒及一种快速、简便、准确、廉价的检测方法，尤其适合基层临床兽医使用。
[0005]本发明通过以下技术方案实现:
设计一种牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测引物，包括一对外引物和一对内引物:
外引物为
F3:5/ -GTGCGTCTGCAGTCTGAG-3'
B3:5/ -GCTGTACACGGTCTCGGAG-3',
内引物为
FIP:5/ -TGCGGATGAGCGCGCAGTCTTTTTCGACGAGGCTCCCT-3/
BIP:5/ -ACGAGACGTGCATCTTCCACCGTACGGCGACGCGAAG-3'。
[0006]本发明还设计一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒，包括扩增反应体系，由以下含量的原料组成:
2 X LAMP Mix10 μ L,
FIP 终浓度0.8ymol/L，
BIP 终浓度0.8ymol/L，
F3 终浓度0.2ymol/L， B3 终浓度0.2ymol/L，
25mmol/L 的 MgCl2 3 μ L,
8U/ μ L 的 Bst DNA 聚合酶 1.5 μ L，
LAMP可见光染料I μ L，余量为蒸馏水，补充至19 μ L0
[0007]对于上述牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒，所述LAMP可见光染料为3mmol/L的羟基萘酚蓝。
[0008]本发明还设计一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，包括以下步骤:
(1)提取待检测组织中的病毒基因组DNA；
(2)将所得基因组DNA定量加入上述扩增反应体系；
(3)LAMP扩增反应:将体系中各反应物混合均匀，置于60°C条件下扩增反应2小时，再在80°C灭活10分钟；
(4)检测结果:直接观察，如果颜色由反应前的浅紫色变成天蓝色，并略显浑浊，则表明发生了 LAMP扩增，即待检测组织中携带牛传染性鼻气管炎病毒；否则待检测组织中不携带牛传染性鼻气管炎病毒。
[0009]对于上述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，所述待检测组织为牛机体组织、鼻腔分泌物、阴道分泌物、气管分泌物、肺脏分泌物或子宫分泌物。。
[0010]对于上述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，所述步骤(I)采用市售病毒DNA抽提试剂盒提取。
[0011]对于上述牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，步骤(2)所述基因组DNA定量为
1.5 μ L，净含量为I?10ngo
[0012]本发明的积极有益效果:
本发明在综合考量DNA序列的保守区、是否形成二级结构、G+C含量、碱基随机分布、长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设计并筛选出特异性强的LAMP引物，建立了牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP快速检测体系及方法，为基层临床兽医提供了快速、简便、准确、廉价的IBRv病原检测保障，填补了 IBRV恒温扩增检测技术的空白。
【具体实施方式】
[0013]以下以具体实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。
[0014]实施例一
本发明根据IBRV毒力基因gE序列，综合考量了其保守区、是否形成二级结构、G+C含量、碱基随机分布、长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，设计出了 LAMP引物并合成，该牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测引物包括一对外引物和一对内引物，外引物为 F3:5' -GTGCGTCTGCAGTCTGAG-3'、B3:5' -GCTGTACACGGTCTCGGAG-3'，内引物为 FIP:5' -ATGCGGATGAGCGCGCAGTCTTTTTCGACGAGGCTCCCT-3/、BIP:5' -ACGAGACGTGCATCTTCCACCGTACGGCGACGCGAAG-3'。
[0015]实施例二
一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测试剂盒，包括扩增反应体系，由以下原料组成: 2 X LAMP Mix10 μ L,
FIP 终浓度0.8ymol/L，
BIP 终浓度0.8ymol/L，
F3 终浓度0.2ymol/L，
B3 终浓度0.2ymol/L，
25mmol/L 的 MgCl2 3 μ L,
8U/ μ L 的 Bst DNA 聚合酶 1.5 μ L，
LAMP可见光染料IyL (3mmol/L的羟基萘酚蓝)，余量为蒸馏水，补充至19yL。
[0016]实施例三
一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法，包括以下步骤:
(1)选用商品化的病毒DNA提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，提取待检测组织中的病毒基因组DNA ；
(2)将所得基因组DNAlμ L (净含Ing)加入扩增反应体系:2XLAMP Mix 10 μ L，FIP终浓度 0.8 μ mol/L, BIP 终浓度 0.8 μ mol/L, F3 终浓度 0.2 μ mol/L, Β3 终浓度 0.2 μ mol/L，25mmol/L的MgCl2 3 μ L，8U/ μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，LAMP可见光染料(羟基萘酚蓝,3mmol/L) IyL,补足蒸懼水到20 μ L ;
(3)LAMP扩增反应:混匀体系中各反应物，置于60°C反应2小时，再在80°C灭活10分钟；
(4)检测结果:直接观察，如果待检测组织携带牛传染性鼻气管炎病毒，则会发生LAMP扩增，颜色由反应前的浅紫色变成天蓝色，并略显浑浊；否则就不携带牛传染性鼻气管炎病毒。
[0017]实施例四
一种牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测方法，包括以下步骤:
(1)选用商品化的病毒DNA提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，提取待检测组织中的病毒基因组DNA ；
(2)将所得基因组DNAlμ L (净含10