VEGFR2基因Val297Ile位点的应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种左旋多巴治疗帕金森病药物敏感性相 关的VEGFR2基因 Val297Ile位点的应用方法。
【背景技术】
[0002] 血管内皮生长因子受体 2 (vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2)属于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK)超家族，主要分布在血 管内皮细胞和淋巴内皮细胞中，是血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)促进血管内皮细胞分裂增殖，提高血管通透性的主要调节因子，并且在 VEGF-A的信号传导中起主导作用。
[0003] 研宄报道左旋多巴（levodopa，L-dopa)治疗帕金森病诱发运动障碍并发症，可能 与血脑屏障功能退化，使得原本难以通过血脑屏障的药物渗入黑质和纹状体，引起L-dopa 脑内有效浓度的变化所致。多项研宄证实L-dopa导致运动障碍与VEGF-A上调，诱导血脑 屏障内皮生成，改变血脑屏障渗透性相关。
[0004] 研宄表明VEGFR2基因多态性与多种疾病相关，并采用了不同的基因分型方法来 进行检查。例如，有研宄采用质谱分型方法证实VEGFR2(rs2071559)多态性与胶质瘤风险 增加有关；有研宄采用Taqman探针法研宄了 VEGFR2-604T/C多态性与鼻咽癌易感性及侵袭 性的关系。质谱分型是针对大样本多位点的高通量分型方法，而Taqman探针法是中通量分 型的金标准，并且具有灵敏度高、花费相对较少的优点。
[0005] Taqman探针法是在PCR上下游引物间选取一段序列作为探针，并在探针上下标记 荧光基团和淬灭基团，该探针可与模板结合，在延伸反应中，当引物合成至探针与模板结合 处时，Taq酶的5'外切酶活性可以降解探针的5'端，使荧光基团与淬灭基团分离，释放荧 光。相对于传统的限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP)，Taqman探针法具有灵 敏度更高、操作更简单的优势，且通路更高。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供VEGFR2基因 Val297Ile位点的应用方法，具体地说是一种检测与 左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关基因的多态性的试剂盒，该试剂盒可用于制备检测与 左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关基因的多态性的试剂。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0008] VEGFR2基因 Val 29711 e位点的应用方法，所述的VEGFR2基因 Val 29711 e位点用于 制备检测帕金森患者对于采用左旋多巴治疗时的药物敏感性的制剂。
[0009] 上述制剂包括试剂盒，特别是包括采用Taqman探针法的试剂盒。
[0010] 所述的试剂盒中含有检测VEGFR2基因 Val297Ile位点的探针和引物，所述探针和 引物能与VEGFR2基因 Val297Ile位点前后的基因序列特异性结合并扩增出包含VEGFR2基 因 Val297Ile位点的基因序列。
[0011] 所述的探针和引物优选是与VEGFR2基因 Val297Ile位点前后500bp的基因序列 特异性结合并能扩增出包含VEGFR2基因 Val297Ile位点的基因序列。
[0012] 所述的试剂盒中含有如下探针：
[0013] VIC-CCTTAACTATAGATGGTGTAACC-MGB ；
[0014] FAM-CTTAACTATAGATGGTATAACC-MGB ；
[0015] 所述的试剂盒中含有如下引物：
[0016] 5' -CAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAAT-3' ；
[0017] 5 ' -GGTCATCAGCCCACTGGAT-3 '。
[0018] VIC和FAM为报告基团，VIC吸收波长515-535nm，发射波长540-560nm ;FAM吸收 波长485-505nm，发射波长515-530nm ;MGB为淬灭基团。
[0019] 上述试剂盒检测时根据FAM与VIC荧光强度相当，说明VEGFR2基因 Val297Ile位 点为AG基因型；VIC荧光强度远大于FAM荧光强度，说明VEGFR2基因 Val297Ile位点为GG 基因型；FAM荧光强度远大于VIC荧光强度，说明VEGFR2基因 Val297Ile位点为AA基因型。
[0020] 本课题组的前期研宄表明，VEGFR2基因多态Val297Ile(rs2305948)可能通过影 响VEGFR2表达水平，从而与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关，而之前并无相关报道。
[0021] VEGFR2蛋白的胞外域包含7个免疫球蛋白样袢。胞外第1袢是与VEGF结合的必 须部位，第2-3袢是与VEGF紧密结合的主要部位，VEGFR2基因 Val297Ile位点编码VEGFR2 胞外域第3袢。在中国汉族人群中，其最小等位基因频率（Minor Allele Frequency, MAF) 为29. 71 %。由于目前还没有有关Val297Ile基因多态性及其功能的相关报道，本课题组近 期研宄才发现其与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相关，所以还没有人检测过VEGFR2基 因 Val297Ile多态性，更没有相关检测的试剂盒产品面世。因此，探索检测与左旋多巴治疗 帕金森药物敏感性相关基因的多态性的方法及产品显得意义深远。
[0022] 本发明的试剂盒能准确、快速、简便地检测与左旋多巴治疗帕金森药物敏感性相 关的基因位点（VEGFR2基因 Val297Ile多态性）。
【附图说明】
[0023] 图1为Taqman探针法检测VEGFR2基因 Val297Ile位点基因型；
[0024] 图2为质谱法检测VEGFR2基因 Val297Ile位点基因型。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0026] 实施例1
[0027] 1.设计Taqman探针及引物
[0028] I. 1查找VEGFR2基因 Val297Ile位点前后500bp序列
[0029] 在 PUBMED SNP 数据库中搜索 VEGFR2,进入 Gene view，选择 NC_000004. 12 转录本 并显示整个基因区域的单核苷酸多态性（SNP)，进入rs2305948,在Fasta sequence中可获 得此多态位点前、后500bp的序列（SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6)，用于寻找合适的探针和 引物。
[0030] CAGGCTATGAATATTAGTTTTCTCTAGGTGATTACATCTTTCCACATTATGTCATTTCTCTGTTCTCCA AAGTTTTTGATCTACATTCCTTTTAAGGGAATTTCTCTTTAAGAGGTGGCATGAGATACACTGCTCCTTAAACAGTG GTCACATTTACTTGTGTTTCTGCAGTTTATATCCATCTCACTTTCACCACGTGAGGTTTTAAAAATCCTAATTCAGT TGGTTCCATTTATTTCTCCTGAAACAAAATATATTTGTTGTCTGCATGAGGTTAAAAGTTCTGGTGTCCCTGTTTTT AGCATTAAATAATGTTTACCAAAGCCCAGATTTAATTCTGTGTGTTACTAGAAGTTATTGGGTAATGTTATATGCTG TGCTTTGGAAGTTCAGTCAACTCTTTTTTTCAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTC TGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGT(SEQ ID NO. 5)
[0031] Y(Y 是指 VEGFR2 基因 Val297Ile 位点）
[0032] TAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCA CATTTGTCAGGGTCCATGGTAAGCTATGGTCTTGGAAATTATTCTGTGCCTTGACAAGTGAGATAATTTAAATAAAT TTAGGTCACTTAGTGATTCCTATTTTGTTCATTCAGAAGATAGTTTCTAGTTTTTCTTGTTAGGGAGGCCACATGAC CTAGAGGTCAAGAGCATAGCTTTGTAGTCAGGAACTTGGGTTCAAACCTCAACTTTAAAGATGAGATGTGCTGATAT ACAGTAAGAGTTCATTTAGTATTACTTATTATAGTTATTGCTGCTATTAGGATTGTTACTATGATAAATAGTATTAG CTAAGGTAGTTTTTAAATTTTCATTTTATTGCAAGGCTGAGAGGCCTACTTGAATAAGCATGAGCTTTGCAAACTGG GGAAACATTTAGCAATATACAGTTGACCTGTGAGCAACTCAGGGAT(SEQ ID NO. 6)
[0033] I. 2利用Primer Express3. 0进行探针和引物设计
[0034] (I)探针设计原则：
[0035] 1.确保G-C含量在20% -80 %之间。
[0036] 2.探针5'端的第一个碱基不能是G。
[0037] 3.用Primer Express软件计算出来的探针Tm值应当在68-7CTC之间。
[0038] 4.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基。
[0039] 5.避免同一碱基重复过多，特别是G，不可超过4个及以上。
[0040] 6.尽量使用含C多于含G的探针。如果C少于G，则使用互补链上的探针。
[0041] 7.如果是SNP，多态性位点尽量位于探针中央。
[0042] (2)引物设计原则：
[0043] 1.在探针确定以后再选择引物。
[0044] 2.引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠