一种微生物絮凝剂的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种絮凝剂的生产方法。
【背景技术】
[0002] 絮凝技术是目前给水和废水处理采用的主要方法，其效果主要取决于絮凝剂种 类。在絮凝技术发展史上，无机盐类絮凝剂（如硫酸铝、氯化铁等）处理效果不理想。而聚 合无机盐型絮凝剂（如聚合氯化铝、聚合硫酸铁等）处理效果虽良好，但用量大，对环境有 二次污染。如，铝离子可毒害水生生物和微生物，通过食物链和饮用水，最终危害人类健康。 而铁系絮凝剂对金属有腐蚀性，且使水有颜色，这使铝及铁盐絮凝剂的应用大受限制。有机 高分子絮凝剂如PAM具有用量少、絮凝速度快，但残留物不易被生物降解，且其单体有强烈 的神经毒性和"三致"效应，造成二次污染，也要限制其应用。生物絮凝剂可称为第三代絮 凝剂，是一种具有高效絮凝活性的微生物代谢产物或化学改性天然有机高分子絮凝剂，它 是利用生物技术，通过微生物的发酵培养，从微生物代谢产物中提取、纯化而获得的新型水 处理剂，其主要成分有蛋白质、多糖、脂类、纤维素、DNA及有絮凝活性的菌体。
[0003] 微生物絮凝剂（Microbial f Iocculant)是一种对污染物具有吸附、中和和絮凝作 用的大分子产品，它具有安全、高效、易生物降解、无二次污染等特点最早发现产絮凝微生 物的是美国科学家But-terfield，他于1935年从活性污泥中筛选出菌胶团产生菌。目前 国外的研宄者已经开发出一系列微生物絮凝剂，有的已经应用到相关废水处理和工业处理 中。
[0004] 传统方法培养菌种时，通常采用营养丰富的培养基，以达到微生物快速生长和最 大生物产量，结果分离的大多为生长快速且偏爱丰富营养的微生物，而且在自然界中，除了 一些利用高浓度营养的微生物种群外，其余可能是以中低营养甚至寡营养的方式生活，在 低营养浓度下，可以吸收足够的有机质维持生长。当微生物从自然环境转移到营养丰富的 人工培养是，一些摄取营养能力强的会应运而生，而寡培养的微生物会因浓度高的营养基 质而抑制生长。而刚果红是一种染料与具有螺旋构象的多糖可以形成络合物，可与像纤维 素这样的多糖物质形成红色复合物。
【发明内容】
[0005] 本发明是要解决现有的絮凝剂生产方法周期长，絮凝剂的絮凝效果差的问题，提 供一种微生物絮凝剂的生产方法。
[0006] 本发明微生物絮凝剂的生产方法，按以下步骤进行：
[0007] 一、挑取不动杆菌接种到富培养基中，于28 °C~35 °C、140r/min~160r/min、 pH6. 5~7. 5的条件下培养18h~24h，得到活化的菌液，将活化的菌液按照5%的接种量， 接入产絮培养基中；
[0008] 二、按照以下条件进行发酵培养：初始pH为6~8,培养温度为15°C~30°C，摇床 转速为120r/min~150r/min，培养时间为20h~30h，得发酵液；
[0009] 三、将发酵液于3000r/min离心10min，收集菌体沉淀，PBS洗2~3遍，然后加入 细菌裂解液，再于冰浴条件进行超声波破碎20min，所得溶液于8000r/min离心5min，收集 上清，加入CTAB，混匀后形成沉淀，静置离心，收集沉淀物，用无水乙醇和丙酮分别清洗沉淀 2~3次，此沉淀即为微生物絮凝剂；将微生物絮凝剂冷冻干燥保存。
[0010] 本发明的有益效果如下：
[0011] (1)本发明方法的生产周期短，微生物絮凝剂的絮凝效果好。
[0012] (2)微生物絮凝剂为微生物菌体或菌体外分泌的生物高分子物质，属于天然有机 高分子絮凝剂，它安全无毒，经鉴定其絮凝成分为多糖，可用于食品、医药等行业的发酵后 处理对人体和动物无任何毒副作用。
[0013] (3)无二次污染，絮凝成分可自行降解。
[0014] (4)微生物絮凝剂价格低廉。微生物絮凝剂是微生物菌体或有机高分子，比化学絮 凝剂便宜。微生物絮凝剂是靠生物发酵产生的，化学絮凝剂是人工合成的。从生产所用原 材料，生产工艺能源消耗等方面考虑，微生物絮凝剂是经济的。
【具体实施方式】
[0015] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0016] 一：本实施方式微生物絮凝剂的生产方法，按以下步骤进行：
[0017] -、挑取不动杆菌接种到富培养基中，于28°C~35°C、140r/min~160r/min、pH 6. 5~7. 5的条件下培养18h~24h，得到活化的菌液，将活化的菌液按照5%的接种量，接 入产絮培养基中；
[0018] 二、按照以下条件进行发酵培养：初始pH为6~8,培养温度为15°C~30°C，摇床 转速为120r/min~150r/min，培养时间为20h~30h，得发酵液；
[0019] 三、将发酵液于3000r/min离心10min，收集菌体沉淀，PBS洗2~3遍，然后加入 细菌裂解液，再于冰浴条件进行超声波破碎20min，所得溶液于8000r/min离心5min，收集 上清，加入CTAB，混匀后形成沉淀，静置离心，收集沉淀物用无水乙醇和丙酮分别清洗沉淀 2~3次，此沉淀即为微生物絮凝剂；将微生物絮凝剂冷冻干燥保存。
[0020] 本实施方式方法的优点为减少能耗，提高生产效率，有效降低生产成本，为最终实 现大规模生物絮凝剂的商品化制备，提供了一种快速的微生物絮凝剂生产方法，用该方法 生产的微生物絮凝剂可以获得高的絮凝效率。
[0021] 本实施方式步骤一所述不动杆菌文件为不动杆菌LLin6 (Acinetobacter sp.)，保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏日期为2014年12月15日，保藏编号为CGMCC No. 10180。
[0022] 步骤三所述细菌裂解液为RIPA裂解液，购买自Biosharp公司。
[0023] 本实施方式不动杆菌是从污泥中筛选得到的，具体步骤如下：
[0024] (a)取活性污泥IOg加入装有90mL无菌水并加有玻璃珠的灭菌三角瓶内，150r/ min摇床震荡20min，使其打散成均匀地悬液，用无菌水稀释成10_3、10_4、10_ 5、10_6、10_7的梯 度，各取0. 2mL的稀释液均匀涂布在含刚果红（浓度为10mg/mL)的寡培养基平板上，30°C 恒温倒置培养2d~3d，培养后挑出有红色、深红、橙色的菌株在液体富培养基培养后在固 体富培养基上进行平板划线分离，连续划线分离纯化得到纯菌种。
[0025] (b)初筛：将分离得到的纯菌株接种到富集培养基中置于摇床33°C，150r/min震 荡培养24h~48h，取培养液ImL接种到产絮培养基中培养24h。在试管中装入20mL 4g/ L高岭土悬浊液，加入几滴絮凝剂样品，观察是否有絮团生成，如果有絮团生成，说明该菌能 产生絮凝剂。
[0026] (c)复筛：取IOmL发酵培养液置于含有5g/L高岭土悬浊液混凝搅拌机中，再加入 10%氯化妈，调节pH至中性，取液面下2cm处样品于550nm处测定吸光度，并以加蒸馏水的 高岭土悬液做空白对照，计算其絮凝活性。公式如下：
[0027] 絮凝率（％) = (A-B)/AX 100%
[0028] A为对照组在550nm处的吸光度，B为样品在550nm处的吸光度，每个样品重复3 次，取平均值。
[0029] (d)菌种保存在含30 %甘油的PBS中于-80 °C冰箱中保存。
[0030] 富集培养基由MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L、葡萄糖5g/L、牛肉膏3. 8g/L、蛋白胨10g/L、琼 脂16g/L、pH 7. 2和蒸馏水组成；
[0031] 产絮培养基由14~18g/L葡萄糖、8~12g/