一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列及其载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药基因工程领域，具体而言，一种编码IER5基因的ShRNA序列的DNA 序列及其载体和应用。
【背景技术】
[0002] 小干扰 RNA(short/small interferencing RNA, siRNA)能引发机体组织细胞功 能的变化，一个分子可以诱发数十甚至数百个革EmRNA个体分子的降解[Tononi G, Cirelli C. Modulation of brain gene expression during sleep and wakefulness: a review of recent findings [J]· Neuropsychopharmacology 2001, 25 (5Suppl):S28_35·]。小发卡或 短发卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA)是一段具有紧密发卡环 的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞，载体中 的U6启动子确保shRNA总是表达；这种装载了 shRNA载体可被传递到子代细胞中去，从而 使基因的沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到 RNA诱导沉默复合物上（RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目 的mRNAs并将其降解。作为一种成熟的分子生物学技术，主要是使特定基因功能丧失从而 确定该基因的功能，其原理是将外源性双链RNA(double strain RNA，dsRNA)导入生物体的 细胞中，使得与dsRNA同源的mRNA在翻译之前即快速降解，从而其相应的靶基因表达受到 抑制。RNA干扰的基本过程是将外源性基因（病毒基因、人工转入基因、转座子等）随机整 合到宿主细胞基因组内，利用宿主细胞进行转录，产生与外源基因互补的dsRNA，随后被类 似于核糖核酸酶ΠΙ的Dicer酶切割成短的21~23nt的双链siRNA。siRNA被解链为正 义链和反义链后，其中反义链与核酸内外切酶、解旋酶和其他因子结合，共同构成RNA诱导 沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC)。激活的RISC通过碱基配对定位到 同源mRNA转录本上，在距离siRNA 3'端12个碱基的位置切割mRNA，使转录的基因表达终 止。每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶，因此，siRNA的反义链作 为引物，以宿主细胞中序列同源互补的mRNA为靶点，在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下形 成新的dsRNA，重复上述过程从而形成大量的siRNA，通过促使特定基因的mRNA降解，在短 时间内来高效、特异地抑制mRNA翻译形成蛋白质或多肽，从而阻断体内特定基因表达，诱 发细胞呈现出特定基因表达降低表型。RNA干扰技术以特异性强、效率高等特点被广泛应用 于基因沉默领域，由于其可以阻断或抑制特定基因表达，从而成为基因治疗的新手段。
[0003] 基因治疗作为治疗恶性肿瘤的一大热门研宄领域，细胞、组织的生物学功能是由 基因调控的，国内外多位学者通过基因芯片技术等发现多种组织细胞经辐射后，其IER5 基因的转录或翻译成倍增加 [Kis E, Szatm ? ri T, S ? fr ? ny G，et al. Microarray analysis of radiation response genes in primary human fibroblasts[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys.2006Dec I ;66 (5):1506-14.],可见该基因与细胞辐射后的生 物学改变密切相关。IER5基因是早期反应家族中的一员，人IER5基因在美国国立生物 技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI)基因库中编 号为NM_016545. 4,全长2350bp，主要参与对外界刺激的快速应答及细胞周期的调节等 [Williams M, Lyu MS, Hunter K, et al. Ier5, a novel member of the slow-kinetics Immediate-Early Genes [J]· Genomics, 1999 Febl ;55(3) :327-34.]。如何通过该基因与放 射生物学效应的关系，并摸清它是通过哪些信号传导途径发挥作用，从而引起肿瘤细胞凋 亡，把宫颈癌的放射治疗提升到一个新的层次。
[0004] 申请号为200810057735. 2公开了编码IER5的siRNA的DNA序列及其载体，但其 使用的质粒载体较旧，重复性差。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一目的在于提供一种编码IER5基因的ShRNA序列的DNA序列，所述的 DNA序列插入载体稳定，沉默IER5基因效果好。
[0007] 本发明的第二目的在于提供一种含有所述DNA序列的载体。
[0008] 本发明的第三目的在于提供DNA序列及其含有该序列的载体在制备治疗宫颈癌 药物中的应用。
[0009] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0010] 一种编码IER5基因的ShRNA序列的DNA序列，所述DNA序列以如SEQ ID NO. 1所 示的正义链和如SEQ ID NO. 2所示的反义链设计得到。
[0011] 一种编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，所述DNA序列以如SEQ ID NO. 3所 示的正义链和如SEQ ID NO. 4所示的反义链设计得到。
[0012] 本发明提供的编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列，是在IER5基因全序列的基 因编码区（Coding Sequence，Q)S)中寻找革巴序列，利用在线siRNA设计软件（WhiteHead)， 参考小干扰RNA设计原则，进行初步设计挑选，从众多序列中筛选得到的两对靶序列，由这 两对靶序列设计的编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列插入载体稳定，沉默IER5基因 效果好。
[0013] 其中，上述靶序列，根据以下原则设计：
[0014] ① GC 含量在 30-52 % ;
[0015] ②第19个碱基不能为G或C ;
[0016] ③正义链5'端第1-4个碱基GC多，第15-19个碱基GC少；
[0017] ④第1个碱基为G或C ;
[0018] ⑤第3个碱基为A，第10个碱基为U，第13个碱基不能为G，第16个碱基为C ;
[0019] ⑥3'端以UU结尾。
[0020] 优选地，所述正义链与所述反义链之间的茎环序列如SEQ ID NO. 5所示。得到的 DNA序列导入细胞中，编码的shRNA序列被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA 诱导沉默复合物上（RISC)，该复合物结合到目的mRNAs，使mRNA迅速、高效降解。
[0021] 为了将编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列与载体连接，以导入细胞发挥作 用，优选地，所述DNA序列的一端添加有BamHl酶切位点，另一端添加有HindIII酶切位点。
[0022] 优选地，所述DNA序列的正义链如SEQ ID NO. 6所示，反义链如SEQ ID NO. 7所示。 该DNA序列根据SEQ ID NO. 1所示的正义链和如SEQ ID NO. 2所示的反义链设计得到。
[0023] 优选地，所述DNA序列的正义链如SEQ ID NO. 8所示，反义链如SEQ ID NO. 9所示。 该DNA序列根据SEQ ID NO. 3所示的正义链和如SEQ ID NO. 4所示的反义链设计得到。
[0024] 经过筛选，得到两对DNA序列，其中一对如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示，另 一对如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示，这两对DNA序列经多方面验证具有更好的沉默 效果。
[0025] 本发明还提供了含有所述的DNA序列的载体。
[0026] 优选地，构建所述载体的质粒为pSilencer4. 1-CMV。
[0027] 本发明还提供了所述的DNA序列在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
[0028] 本发明还提供了所述的载体在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0030] (1)本发明提供了两对能有效抑制IER5基因的表达的DNA序列；
[0031] (2)本发明构建了能稳定表达含有编码IER5基因的shRNA序列的DNA序列的载 体；
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