血管内皮细胞的快速提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域中血管内皮细胞的快速提取方法。
【背景技术】
[0002]在肿瘤的发生和发展过程中，肿瘤血管在此过程中所扮演的角色至关重要。当瘤体生长到Imm3大小时，就分泌了大量的血管内皮细胞生长因子VEGF，诱使瘤体周围生长出许多自己专属的肿瘤新生血管。这些肿瘤血管呈奇特的螺旋状，连接在正常血管上，在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上，它与正常血管存在明显差异。
[0003]肿瘤血管新生分为血管生成(ang1enesis)和血管发生(vasculogenesis)，前者是宿主成熟血管发展而来，后者则是由骨髓或循环系统中的内皮祖细胞，在肿瘤微环境中各种细胞因子的刺激下，定向诱导分化而来。除此之外，肿瘤血管还存在血管共生(vesselco opt1n)和血管拟态(vasculogenic mimicry)两种形式。血管拟态多见于侵袭性较高的肿瘤组织，其内不含内皮细胞，完全由肿瘤细胞构成，在结构和功能上类似血管，被看作是肿瘤组织的另一套循环系统。
[0004]以肿瘤供养血管网为靶点的药物是提高肿瘤治愈率的一种新方法。正是这种固有差异为新药物的设计和治疗策略的高度选择性提供了多种独特的靶点。但是在现有的肿瘤血管内皮细胞提取方法上，不能获得大量的肿瘤血管内皮细胞，为研宄其机制及作用带来很大的影响。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是如何提高提取肿瘤血管内皮细胞的提取量及质量。
[0006]为解决上述技术问题，本发明首先提供了肿瘤血管内皮细胞的提取方法。
[0007]本发明所提供的肿瘤血管内皮细胞的提取方法，包括SI)和S2):
[0008]SI)用眼科剪剪碎离体的肿瘤组织得到肿瘤单细胞；
[0009]S2)分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。
[0010]上述方法中，所述眼科剪又称眼科手术剪、眼用手术剪，是剪切眼部软组织用的器械。所述眼科剪可为头端宽0.4毫米，尖而不锐的眼科剪；所述眼科剪也可为头端宽1.6毫米的眼科剪。
[0011]所述眼科剪具体可为张家港市大都医疗器械有限公司的型号为YYJ-PT > 1cm的弯剪。
[0012]所述离体的肿瘤组织可在PBS中浸泡1-3分钟后用所述眼科剪剪碎得到所述肿瘤单细胞。
[0013]上述方法中，所述SI)可包括Al)和A2):
[0014]Al)用所述眼科剪剪碎所述离体的肿瘤组织得到破碎肿瘤组织；
[0015]A2)向所述破碎肿瘤组织中加入酶进行消化得到所述肿瘤单细胞。
[0016]所述破碎肿瘤组织的大小可为0.027-0.125mm3,具体可为(0.3-0.5)mmX (0.3-0.5)mmX (0.3-0.5)mm。
[0017]上述方法中，所述用所述眼科剪剪碎所述离体的肿瘤组织得到破碎肿瘤组织还可包括向所述离体的肿瘤组织和/或所述破碎肿瘤组织上添加PBS的步骤。
[0018]上述方法中，所述酶可为胶原酶和/或胰酶。
[0019]上述方法中，所述A2)可包括BI)和B2):
[0020]BI)向所述破碎肿瘤组织中加入胶原酶进行消化得到胶原酶消化后的肿瘤组织；
[0021]B2)向所述胶原酶消化后的肿瘤组织中加入胰酶进行消化得到所述肿瘤单细胞。
[0022]上述方法中，所述BI)可包括C1)、C2)和C3):
[0023]Cl)向所述破碎肿瘤组织中加入胶原酶溶液得到胶原酶-肿瘤组织混合物；
[0024]C2)将所述胶原酶-肿瘤组织混合物在震荡器上进行震荡，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物；
[0025]C3)将所述震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37°C孵育，得到所述胶原酶消化后的肿瘤组织。
[0026]上述方法中，C2)所述震荡的时间可为3-5分钟。C2)所述震荡的频率可为1500-2000rpm，具体可为1700rpm。C3)所述孵育可在37°C水浴锅中进行；所述孵育的时间可为1-3分钟。
[0027]上述方法中，所述C2)和所述C3)可交替进行10-15次。
[0028]上述方法中，所述胶原酶可为胶原酶I。
[0029]上述方法中，所述胶原酶溶液可为胶原酶I溶液。所述胶原酶I溶液可为向DMEM完全培养基中加入胎牛血清(FBS)和P/S得到的溶液，其中所述胎牛血清的体积百分比浓度为10%，所述P/S的体积百分比浓度为1%。所述P/S为向超纯水(DDH2O)中加入胶原酶1、青霉素和链霉素得到溶液。所述P/S中胶原酶I的浓度可为10mg/ml，所述青霉素的浓度可为100u/ml，所述链霉素的浓度可为100u/ml。所述胶原酶I溶液中胶原酶I的浓度可为 1000mg/ml。
[0030]所述DMEM完全培养基具体可为Gibco公司产品，货号为11995-065。所述胎牛血清具体可为Gibco公司产品，货号为10099-141。所述胶原酶I具体可为北京索莱宝科技有限公司产品，货号为C8140-100。
[0031]上述方法中，所述方法还包括将所述胶原酶消化后的肿瘤组织进行洗涤的步骤。所述洗涤可用PBS进行。
[0032]上述方法中，所述B2)可包括Dl)和D2):
[0033]Dl)向所述胶原酶消化后的肿瘤组织中加入胰酶得到胰酶-肿瘤组织混合物；
[0034]D2)将所述胰酶-肿瘤组织混合物在震荡器上进行震荡，得到所述肿瘤单细胞。
[0035]上述方法中，D2)所述震荡的时间可为8-12分钟。所述震荡的频率可为1500-2000rpm，具体可为 1700rpm。
[0036]上述方法中，所述胰酶可为胰酶溶液。所述胰酶溶液可为向DDH2O中加入NaCl、NaHCO3、葡萄糖、EDTA和胰酶得到的溶液，其中，所述NaCl的浓度可为0.8g/ml，所述NaHCO3的浓度可为0.05g/ml，所述葡萄糖的浓度可为0.lg/ml，所述EDTA的浓度可为0.03g/ml，所述胰酶的浓度可为0.25g/mlo
[0037]上述方法中，所述方法还包括将所述肿瘤单细胞进行洗涤的步骤。所述洗涤可用PBS进行。
[0038]上述方法中，所述提取方法中可利用免疫磁珠法分选所述肿瘤单细胞得到所述肿瘤血管内皮细胞。所述利用免疫磁珠法分选所述肿瘤单细胞所用免疫磁珠偶联CD105抗体。
[0039]上述方法中，所述利用免疫磁珠法分选所述肿瘤单细胞的具体方法可包括Hl)、H2)和 H3):
[0040]Hl)用溶液A重悬所述肿瘤单细胞得到肿瘤单细胞悬浮液；
[0041]H2)向所述溶液A中加入磁珠分离液，混合均匀后于磁力架上放置后弃上层液体，用所述溶液A重悬沉淀得到磁珠混悬液；
[0042]H3)将所述肿瘤单细胞悬浮液和所述磁珠混悬液混合后进行细胞的分选，去除所述磁珠得到所述肿瘤血管内皮细胞。
[0043]其中，所述肿瘤单细胞悬浮液和所述磁珠悬浮液的体积比可为9:1。所述溶液A可为向0.0lM PBS中加入BSA得到的溶液，所述溶液A中所述BSA的浓度可为0.lmg/100mL.
[0044]上述方法中，所述去除所述磁珠具体可用release buffer去除。
[0045]其中，所述release buffer具体可为德国美天旎生物技术有限公司(MACS)产品，货号为 130-051-201。
[0046]上述方法中，所述方法还包括将所述肿瘤单细胞过筛子进行过滤的步骤。所述筛子具体可为80目的筛子。
[0047]上述方法中，所述肿瘤可为恶性肿瘤，如肺癌和/或肝癌和/或肠癌和/或前列腺癌和/或胰腺癌等。所述肿瘤可为人肺腺癌。所述肿瘤具体可为在SCID小鼠上生长的人肺腺癌。
[0048]本发明中，所述PBS可为0.0IM PBS。
[0049]本发明中，所述震荡器可为IKA产品，型号为VORTXl。
[0050]本发明中，所述眼科剪也可用其他将肿瘤组织充分剪碎的工具替代。
[0051 ] 实验证明，利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞纯度非常高，肿瘤血管内皮细胞高表达⑶105，表达率为97.3%。成管实验结果显示肿瘤血管内皮细胞抱团形成管腔，此为血管内皮细胞的一个重要特征，而Dil-acLDL实验结果也显示肿瘤血管内皮细胞可以吞噬Dil-acLDL，表明肿瘤血管内皮细胞具有内皮细胞的功能，表明利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的细胞为肿瘤血管内皮细胞。本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法提取血管内皮细胞所需时间短，2-3小时时间即可完成肿瘤血管内皮细胞的提取。实验证明，可利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法提取肿瘤血管内皮细胞。
【附图说明】
[0052]图1为从荷瘤小鼠剥离得到的肿瘤组织。
[0053]图2为用眼科剪充分剪碎肿瘤组织得到的剪碎的肿瘤组织。
[0054]图3为肿瘤血管内皮细胞的提取过程中用到的振荡器和水浴锅。其中，A为振荡器；B为水浴锅。
[0055]图4为将分选得到的肿瘤血管内皮细胞进行培养得到的贴壁的肿瘤血管内皮细胞。
[0056]图5为利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞的⑶105的表达率。
[0057]图6为利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞的成管实验结果。
[0058]图7为利用本发明的肿瘤血管内皮细胞的提取方法得到的肿瘤血管内皮细胞的Dil-acLDL吞噬实验结果。
【具体实施方式】
[0059]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060]下述实施例中的眼科剪为张家港市大都器械医疗有限公司的型号为YYJ-PT >1cm的弯剪。该眼科剪头端宽0.4毫米，尖而不锐。
[0061]下述实施例中的人肺腺癌A549细胞为ATCC产品，货号为CCL-185。
[0062]下述实施例中的SCID小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。
[0063]下述实施例中的胎牛血清(FBS)为Gibco产品，货号为10099-141。
[0064]下述实施例中的胶原酶I溶液为向DMEM完全培养基(Gibco，货号11995-065)中加入胎牛血清(FBS，Gibco公司产品，货号为10099-141)和P/S得到的溶液，其中胎牛血清的体积百分比浓度为10%，P/S的体积百分比浓度为1%。P/S为向超纯水(DDH2O)中加入胶原酶I (北京索莱宝科技有限公司，货号:C8140-100)、青霉素(索莱宝，货号P8420)和链霉素(索莱宝，货号S8290-5)得到溶液，P/S中胶原酶I的浓度可为10mg/ml，青霉素的浓度为100u/ml，链霉素的浓度为100u/ml。该胶原酶I溶液中胶原酶I的浓度为100mg/ml ο
[0065]下述实施例中的胰酶溶液为向DDH2O中加入NaCl、NaHC03、葡萄糖、EDTA和胰酶得到的溶液，其中，NaCl的浓度为0.8g/ml，NaHCOj^浓度为0.05g/ml，葡萄糖的浓度为0.1g/ml，EDTA的浓度为0.03g/ml，胰酶的浓度为0.25g/ml。
[0066]下述实施例中的release buffer为德国美天旎生物技术有限公司(MACS)产品，货号为 130-051-201。
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