利用(s)-羰基还原酶ii/e228s的孢子微胶囊酶立体选择性制备(r)-苯乙醇的方法
【技术领域】
[0001]利用(5)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶立体选择性制备U)-苯乙醇的方法，本发明涉及蛋白质工程技术改造(5)-羰基还原酶II催化苯乙酮的底物选择性，通过基因工程技术构建重组酿酒酵母突变株，诱导培养使酵母产生子囊孢子包埋突变蛋白，形成微胶囊酶，高效制备U)-苯乙醇，属于生物催化不对称转化技术领域。
【背景技术】
[0002]手性化合物作为手性合成的中间体，在医药、农药、和食品添加剂等精细化工中应用广泛。羰基还原酶催化合成手性醇时，一般仅能催化其天然底物，这就要求对野生型羰基还原酶进行理性改造，赋予其新的催化功能，能催化非天然底物，获得非天然的手性产物。
[0003]定点突变技术可以有效改变(5)-羰基还原酶II催化的底物选择性。通过氨基酸序列和蛋白结构比对的方法，选择(5)-羰基还原酶II的底物结合域中关键氨基酸位点实施突变，构建相应的突变株，可有效提高其催化苯乙酮底物的效率。
[0004]酿酒酵母以其安全、蛋白表达调控等优势逐渐成为优良的表达宿主。当酵母细胞在营养匮乏时产生具有四层网状膜结构的子囊孢子，以抵御外界不良环境，同时拦截外源大分子，只允许小分子物质(底物、产物和辅酶等)进出孢子，为孢子内胶囊酶提供一个相对独立，几乎无外酶干扰的催化内环境。因而酵母孢子是一种极具潜力的酶固定化载体。
[0005]本实验室定点改造了近平滑假丝酵母(Candida parapsi1sis) CCTCC NO:M203011 的(5)-羰基还原酶 II，获得了重组菌株coli BL21/pET_E228S。研宄发现该突变体具有催化非天然底物苯乙酮的活性。在此基础上，将突变基因克隆至酿酒酵母AN120中表达，通过加入醋酸钾作为唯一能源物质诱导培养产生孢子，包埋突变蛋白，形成微胶囊酶。以微胶囊酶为生物催化剂，苯乙酮为底物进行生物转化。该微胶囊酶不仅能高效手性转化，而且环境具有很好的耐受性；同时，微胶囊酶连续使用20批次后仍能保持较高水平的转化效率。本发明通过基因工程技术构建微胶囊酶，成功克服了(5)-羰基还原酶II底物选择性差及酶蛋白对环境耐受性差的缺陷，从而实现了微胶囊酶高效不对称转化制备U)-苯乙醇。
【发明内容】
[0006]( I)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种蛋白质工程技术改造的微胶囊酶，利用重组酿酒酵母(菌种保藏号:CCTCC N0:M2015099)不对称转化制备U)-苯乙醇的方法。本发明目的在于根据已经解析出来的蛋白结构，利用定点改造技术，基因工程法将突变体表达于酿酒酵母AN120孢子中，形成微胶囊酶，改变该酶的立体选择性和产物空间对映性，提高酶的使用批次。该微胶囊酶不对称还原苯乙酮制备光学活性U)-苯乙醇，连续使用20批次后，产物光学纯度高达99%，转化率高于81%。对(5)-羰基还原酶II进行定点突变后进行微胶囊化，不仅开发了该酶的催化转化非天然产物的新功能，而且显著提高了酶的催化稳定性，为工业上高效、低成本制备光学纯U)-苯乙醇奠定了坚实的基础。
[0007](2)技术方案:一株生产用于不对称转化制备(功-苯乙醇的孢子的重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母(5: cereKi5iae)AN120/pRS424-TEFpr-5crII/E228S,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO:M2015099o
[0008]利用所述的重组酿酒酵母生产(5)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶的方法，在于:
Yro液体培养基以g/L计:胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，pH 7.0，以去离子水配制；固体培养基添加15琼脂粉；
YPACE液体培养基以g/L计:KAc 20，胰蛋白胨20，酵母提取物10，以去离子水配制； 产孢培养基以g/L计:KAc 20，以去离子水配制；
培养条件:挑取重组酿酒酵母CCTCC NO:M2015099的单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养16 h ;取10 mL培养液转接于I L的YPACE液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养24 h后，6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，并转入I L的产孢培养基中继续培养2-3 d，用显微镜镜检产孢效率；产孢完成后，6000 rpmUO min离心收集菌体并以pH 6.5的少量磷酸缓冲液重悬菌体，以超声细胞破碎仪处理I h，工作强度50%、工作时间I S、工作间隙3 s后，离心收集孢子，即得(5)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶，待用。
[0009]利用所述方法制备的(5)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶不对称转化制备U)-苯乙醇的方法，将改造后的突变基因E228S通过构建重组质粒pRSAZfTEFpr-scrll/E228S转入酿酒酵母AN120中，利用诱导培养获得的(5)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶；以苯乙酮为底物，催化不对称转化反应:在I mL pH5.0~5.5的0.1 mol/L醋酸缓冲液，或 I mL pH 6.0-7.5 的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液，或 I mL pH 8.0-9.0 的 0.1 mol/LTris-HCl缓冲液中，孢子浓度为0.1 g/mL，苯乙酮底物浓度为6 g/L，及与苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，反应温度30 °C，反应时间5 h。
[0010]所述的重组酿酒酵母ANUO/pRSAZA-TEFpr-scrll/EZZSS的构建方法:
YPD液体培养基以g/L计:胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；SD-Trp培养基:葡萄糖2%，氨基酸干粉混合物6.7 g/L, YNB 2%，以去离子水配制；固体培养基添加20琼脂粉；
培养条件:挑取酿酒酵母AN12 O单菌落接种于5 mL的YI3D液体培养基中，3 O °C、200rpm震荡培养16 h，取I mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 yL组成为 IM DTT 10 yL、50% PEG 80 yL、2M LiAc 10 yL 的 Buffer 重悬菌体，加入重组质粒pRSAZ^TEFpr-scrll/EZZSS I μ L，轻轻混匀后于45°C温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30°C倒置培养。
[0011]重组质粒pRSAM-TEFpr-scrn/EMSS 的构建:
利用限制性内切酶I和ZAo I，质粒pET-28a-.5^τΙΙ/Ε2283与载体pRS424_TEFpr分别进行双酶切处理，经切胶回收浓缩后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pRS424-TEFpr- 5crII/E228So
[0012]质粒pET-28a_.5^τΙΙ/Ε2285 的获得: 以pEI^Sa-scrll为模板，利用全质粒PCR引物进行PCR反应；
E228S_F:5’ -TTTCTGATTT TGTTAGTAAA GACATGAAAG C-3’，
E228S_R:5’ -GCTTTCATGT CTTTACTAAC AAAATCAGAA A_3’ ；
PCR 反应体系:ddH20 41 μ L，10 X React1n Buffer 5 uL,25 mmol/L 的 dNTP 0.5yL，50 pmol/yL 的引物 E228S_F 和 E228S_R 各 I μ L，质粒 ρΕΤ-28α-.5^τΙΙ I yL,5 U/μ L 的 Taq DNA polymerase 0.5 μ L ；
PCR 反应:94°C 预变性 5 min ；94°C I min, 60°C 30 s，72°C 7 min，进行 30 个循环；72°C延伸10 min ;PCR反应结束后，向反应体系中加入/??? I I μ L，置于37°C水浴锅中酶切I h去除原始模板质粒。
[0013]pET-28a-5crII 质粒的获得:
利用限制性内切酶I和通ο I，基因scrll与载体pET-28a分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒ρΕΤ-28&-.5^τΙΙ。
[0014]基因scrll的获得:
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有I和通ο I限制性酶切位点的引物 SCR_F，SCR_R:
SCR_F:5’ -TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’，SCR_R:5’ -CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’ ；
PCR反应体系:ddH20 37 μ L，10 X React1n Buffer 5 uL,25 mmol/L dNTP 0.5 μ L，50 pmol/yL 的引物 SCR_F 和 SCR_R 各 I μ L，基因组 DNA 5 yL，5 U/μ L 的 Taq DNApolymerase 0.5 μ L；
PCR反应过程:94°C 预变性5 min ；94°C I min,60 °C 30 s、72°C I min，进行30个循环；72°C延伸 10 min。
[0015]用于获得scrll基因所需要提取的近平滑假丝酵母基因组的菌种为近平滑假丝酵母 iC.parapsilosis) CCTCC NO:M203011。
[0016]一、基因组的获得
近平滑假丝酵母ic.parapsilosis) CCTCC NO:M203011的培养基组成为:葡萄糖2%，酵母膏1%，胰蛋白胨2%。
[0017]将近平滑假丝酵母CCTCC NO:M203011接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30°C、200 rpm振荡培养16 h。培养结束后，将菌体于6，000 rpm、20 min下离心，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extract1nMiniprep System (V10G