一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurA1的利记博彩app
【技术领域】 本发明设及一种细菌表面抗原重组蛋白，该蛋白设及疾病亚单位疫苗制备技术领域， 同时该蛋白是一种对细胞具有毒力的蛋白。具体设及一种鲍曼不动杆菌免疫保护性抗原的 鉴定，蛋白基因的克隆W及它编码的重组蛋白在疫苗中的应用，同时该蛋白对人类肺上皮 细胞A549具有毒性。
【背景技术】 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii)是一种重要的条件致病菌。近年来由于抗 生素滥用，且其耐药性日益严重，已引起研究者的严重关注。A.baumannii主要引起呼吸道 感染，也可引发败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。A. baumannii在多种严酷环境中分布 且可长期存活，对免疫缺陷患者威胁很大。 2011年吉林某鸡场发生一起由于饲料污染鲍曼不动杆菌导致60000多只维鸡发病、 3000多只维鸡直接死亡的事件，造成严重的经济损失。先前该家公司先后发生3次类似事 件，损失都很严重。我们课题组经过剖检、病理观察、病原分离、菌株形态观察和生理生化试 验W及基因序列测定等手段，鉴定引起此次维鸡死亡的病原为鲍曼不动杆菌（CCGGD2011)， 并将分离的菌株通过回归实验，感染1周龄维鸡和6-8周龄小鼠，获得了同样的感染致死能 力（菌株保存于吉林大学人兽共患病研究所细菌病实验室）。CCGGD201101引起了维鸡患 病，最终引起大部分维鸡死亡，表现出较强的致病性，该与常见的鲍曼不动杆菌不同，表现 出毒力增强的现象。因为鲍曼不动杆菌耐药性日益严重，对于感染鲍曼不动杆菌后的治疗， 常规抗生素可能无效，寻找其主要毒力因子，W此为基础，开发新型的免疫药物，将会对预 防鲍曼不动杆菌感染发挥重大作用。 免疫保护性抗原通常是细菌重要的毒力相关因子，在细菌的粘附、侵袭等致病过程和 宿主的免疫应答中发挥重要作用。许多鲍曼不动杆菌的表面蛋白已被鉴定为保护性抗原分 子，然而由于该部分蛋白的生物学功能尚不清楚，其是否在A. baumannii的致病过程中发 挥作用还需要进一步的研究。在致病过程中，病原菌的表面蛋白很有可能直接参与和宿主 细胞相互作用。
【发明内容】
本发明提供一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl，用于制备鲍曼不动 杆菌亚单位疫苗。 本发明采取的技术方案是： 一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所 述。 编码所述的一种具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl的核巧酸，其序列如 SEQ ID No. 2 所述。 包含所述的核巧酸的重组载体祀T-28a-SurAl。 包含所述的重组载体的大肠杆菌工程菌株。 所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl，对于人类肺上皮细胞A549具 有弱毒性，对小鼠具有免疫保护性。 所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl在制备鲍曼不动杆菌亚单位 疫苗中的应用。 所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl在制备用于预防由鲍曼不动 杆菌引起的疾病的药物中的应用。 一种包含所述的具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl的疫苗组合物。 一种制备具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原的方法，所述方法包括W下步骤： 构建包含含有SEQ ID No. 2所述的核酸序列的重组表达载体； 将所述重组表达载体转到宿主菌中； 培养所述经转化的宿主菌并诱导其表达所述鲍曼不动杆菌免疫保护性抗原； 对所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化所述鲍曼不动杆菌免疫保护性抗原。 所述的方法中，宿主细胞是大肠杆菌。 本发明通过巧光差异双向电泳技术对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,A. baumannii)全组分进行蛋白表达差异分析。目的筛选出抗原性好，保护力强的抗原蛋白，同 时筛选出毒力相关蛋白，W期为发展新型亚单位疫苗的研发及血清学诊断标记奠定坚实的 基础。 本发明鉴定到具有免疫保护效果的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl蛋白，来源于鲍曼 不动杆菌CCGGD201101，该菌是吉林大学人兽共患病研究所细菌病研究室于2011年在 吉林省农安县某养鸡场病死维鸡中分离，经过生理生化鉴定和16s rDNA测序鉴定证明 CCGGD201101为鲍曼不动杆菌，在动物回归实验中证明CCGGD201101对维鸡、小鼠、大蜡惧 均具有致病性。从CCGGD201101分离到的SurAl蛋白对小鼠感染鲍曼不动杆菌能提供有效 的免疫保护力，可W作为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗的候选抗原。 为了实现本发明目的，本发明首先分离鲍曼不动杆菌CCGGD201101的全组分蛋白和参 考菌株ATCC17978的全组分蛋白，然后通过差异巧光双向电泳技术分离的到表达量差异蛋 白。对表达量差异蛋白进行质谱鉴定，随后对SurAl蛋白的基因进行克隆、表达、纯化。使 用感染鲍曼不动杆菌后康复小鼠的血清检测SurAl蛋白，发现重组SurAl蛋白可W与康复 血清反应。使用人工重组的SurAl蛋白进行小鼠的免疫保护性实验，结果表明其具有一定 的免疫保护作用。 本发明具有免疫保护性的鲍曼不动杆菌表面抗原SurAl,该蛋白对与人类肺上皮细胞 A549表现出弱毒性，对小鼠感染鲍曼不动杆菌能提供有效的免疫保护力，可W作为鲍曼不 动杆菌亚单位疫苗开发的候选抗原。
【附图说明】 图1(A)是编码SurAl蛋白的基因扩增图； 图1炬）是SurAl基因表达载体双酶切载体构建图； 图2是SurAl蛋白的表达及纯化图； 图3(A)是不同鲍曼不动杆菌感染小鼠康复血清中抗SurAl抗体滴度图； 图3(B)不同鲍曼不动杆菌感染小鼠康复血清中抗SurAlWestern blot图； 图4是SurAl亚单位疫苗免疫后抗CCGGD201101感染研究； 图5是SurAl亚单位疫苗免疫后抗ATCC17978感染研究； 图6是SurAl免疫后小鼠细胞因子表达水平分析图； 图7是SurAl免疫后小鼠血清效价水平及产生抗体类型分析图； 图8是SurAl对人类A549细胞杀伤活性图。
【具体实施方式】 W下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定于本发明。下述实施例中得实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生 化试剂商店购买。 实施例1、细菌蛋白样品的制备 蛋白样品制备 取-80°C冰箱冻存鲍曼不动杆菌标准株ATCC19606和分离株CCGGD201101各ImU分别 接种于200血液体LB培养基中培养，37°C恒温18化/min培养化。离屯、前称取50血离屯、 管重量并分别标记，4°C，lOOOOr/min离屯、lOmin弃上清，并用灭菌水反复离屯、清洗两次弃 上清，收集菌体称取总重量，并计算收集细菌重量。ATCC19606和CCGGD201101均加入lOmL 0.1mol/L Tris-Cl悬浮沉淀，再加入lOOuL蛋白酶抑制剂与lOOuL核酶混合物充分混匀。 然后进行超声破碎，功率为200W，5s/次，每次间隔15s，各超声lOmin，整个过程冰上操作。 4°C，10000Xg 离屯、20min 取上清。
[0040] 二、全组分蛋白样品的巧光差异双向电泳值IGE) 蛋白样品的巧光标记 用BCA法进行蛋白定量，用精确抑试纸调节样品抑至8. 5。每4(K)pmol染料标记 50ug蛋白。luL染料工作液（400pmol/mL)加入50ug蛋白样品中混匀，离屯、，避光，冰浴 30min ;再加入luL lOmmol/mL赖氨酸，避光，冰浴15min进行泽灭。切2标记ATCC19606和 CCGGD201101各25 y g蛋白混合物作为内标，切3标记50ug ATCC19606蛋白，切5标记50ug CCGGD201101蛋白，做两个重复，再将切3标记CCGGD201101蛋白，C巧标记ATCC19606蛋白 共=个重复同时进行凝胶电泳。 双向电泳实验 (1) 从-80°C冰箱取出标记蛋白，将标记切2、切3、切5 S个样品混合，加入水化液至 450祉，并加入1. 4mg DTT和2.加L IPG buffer充分混匀。 (2) 将混合样品均匀加入到24cm胶条槽中，用綴子夹住IPG干胶条负极端胶面朝下，由 正极端缓慢放入胶条槽中，胶面与水化液间不能产生气泡，加入l-2mL覆盖油于胶条上表 面，盖上盖子。 SDS-PAGE垂直电泳 (1) 灌胶；配制12. 5%的聚丙締酷胺凝胶250mU放入超声波清洗器中除泡lOmin，再加 入AI^S和TM邸慢慢混匀。将配好的凝胶溶液对准灌胶模具中间凹槽滑坡面，缓慢倒入防止 气泡产生，并用正了醇封胶，室温凝胶化。 (2) 胶条平衡；取出等电聚焦后的IPG胶条垂直于滤纸上吸取覆盖油，将胶面朝上放 入含1% DTT的平衡液的平衡管中，放在脱色摇床上缓慢震荡15min ;取出胶条再放入含 2. 5% IAA的平衡液的平衡管中，缓慢震荡15min。 (3) 装胶条：将凝胶玻璃板中的正了醇倒掉，用蒸馈水清洗，并用滤纸将水吸干。胶板 平放于实验台上，用綴子夹住平衡后的胶条两端，胶面朝上放在凝胶板上，用洁净薄尺将负 极端推入，避免触碰胶面；将胶板直立沿负极端加入0. 5%低烙点琼脂糖封胶，用薄尺向正 极端推入，边加边推，防止胶面与胶条之间有气泡产生。 (4) 电泳；将胶板放入电泳槽中并用遮光罩盖住进行垂直电泳。整个电泳过程均在 20°C循环水浴下进行，设置电泳仪参数为600V，400mA，7h。当漠酪藍移动到胶底部时电泳结 束，取下胶板进行扫描分析。 凝胶图像扫描和分析 应用Ty地oon FLA9500巧光扫描仪在473皿、532皿、635皿的激发波长下分别收集切2、 切3、切5标记的成像。成像需先在1000 ym出进行预扫描，然后使用100 ym精度扫描。其 中光电倍增管PMT的设置范围为250V-1000V，即S个通道中高丰度蛋白的Max Intensity 值均在6