抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白orf46的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程领域，具体涉及斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白0RF46基因编 码的重组蛋白、由其制备的单克隆抗体及应用。
【背景技术】
[0002] 斑点叉尾鮰病毒病（channelcatfishvirusdisese，CCVD)是斑点叉尾鮰鱼苗及 幼鱼的主要传染性疾病，能够在短时间内造成40%~90%的鱼苗的死亡，危害严重，该病 的病原1971年被确认为斑点叉尾鮰病毒（channelcatfishvirus，，CCV)。国内外检测这 种病毒的方法主要有中和试验、点杂交检测技术、PCR技术、实时定量荧光探针PCR技术、免 疫荧光技术等。这些方法虽然准确可靠，但因具有操作繁琐、检测周期长等缺点，不能满足 快速确诊病原、及时控制疫情的实际工作需求，因此建立更灵敏快捷的检测技术对该病的 防治具有重要的现实意义。近年建立在单克隆抗体基础上的间接免疫荧光（IF)和酶联免 疫吸附试验（ELISA)已在鱼类病毒的检测中广泛报道，而目前关于斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋 白0RF46的敏感性、特异性较强的单克隆抗体还未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个目的是提供一种斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白0RF46基因编码的重 组蛋白。
[0004] 本发明的第二个目的是利用上述重组蛋白制备一种抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白 0RF46的单克隆抗体。
[0005] 本发明的第三个目的是提供所述单克隆抗体在检测斑点叉尾鮰病毒中的应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0007] -种斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白0RF46基因编码的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0008] 编码所述重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0009] 所述的重组蛋白作为斑点叉尾鮰病毒囊膜抗原蛋白的应用。
[0010] -种单克隆抗体，它是由所述的重组蛋白免疫动物后得到的杂交瘤细胞株3B8 所分泌的，所述杂交瘤细胞株3B8保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC C2014242。
[0011] 所述的单克隆抗体在检测斑点叉尾鮰病毒中的应用。
[0012] 本发明的优点在于：提供了抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白0RF46的单克隆抗体和产 生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明提供的单克隆抗体特异性强、生物结合活性高，与 感染斑点叉尾鮰病毒的CC0细胞（斑点叉尾鮰卵巢细胞）发生反应，而不与正常的CC0细 胞反应，可应用于制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂盒，用于斑点叉尾鮰病毒的检测，检测时 反应灵敏，从而为建立斑点叉尾鮰病毒的快速检测方法奠定了基础，为该病毒的早期诊断、 临床快速检测、流行病学调查提供了有效的工具。
【附图说明】
[0013] 图1是斑点叉尾鮰病毒免疫印迹法检测的荧光显微照片，图中1为CCO正常细胞， 2为感染斑点叉尾鮰病毒的CCO细胞。
[0014] 图2是斑点叉尾鮰病毒间接免疫荧光检测的荧光显微照片，图中A为感染斑点叉 尾鮰病毒的CCO细胞，B为CCO正常细胞。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1抗原的制备
[0016] 1.斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白0RF46基因片段的PCR扩增
[0017]根据斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白0RF46基因序列（GenBank登录号：AAA88149.1)，并 分析蛋白0FR46的免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果显示在233-590位氨基酸片段的 亲水性及抗原指数较高且位于膜外区，故选取233-590位氨基酸的基因序列设计引物，以 斑点叉尾鮰病毒的DNA为模板，PCR扩增该序列。其中，扩增的引物序列分别在上、下游引 物中加入BamHI、HindIII，上游引物加入起始密码子，下游引物加入终止密码子。
[0018]上游引物为：5'-AAAGGATCCATGTGTTACGGTCCGTTGGCC-3'，
[0019]下游引物为：5' -AAAAAGCTTTCAAGAGAAATCGACGGCGT-3,，
[0020] 划线部分为酶切位点。
[0021] 2.斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白0RF46基因片段原核表达质粒的构建
[0022] 斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白0RF46基因片段和pGEX-KG载体分别用BamHI、HindIII 双酶切后，使用胶回收试剂盒回收酶切目的片段和载体，然后在T4DNA连接酶的作用下 16°C进行连接，所得到的阳性重组质粒CCV-0RF46-KG送到北京擎科新业生物技术有限公 司进行测序确认。
[0023] 3.重组质粒CCV-0RF46-KG的诱导表达
[0024] ①将阳性重组质粒CCV-0RF46-KG转化大肠杆菌感受态BL21 (DE3)。
[0025] ②将所得CCV-0RF46-KG的阳性菌液按1:100接种到含相应抗生素的LB液体培养 基中，37°C摇床上180r/min培养。
[0026] ③培养至0D6J直在0? 5-0.6之间，加入IPTG使终浓度为1. Ommol/L，37°C摇床上 180r/min诱导 4h。
[0027] ④诱导结束后，8, 000r/min离心5min，收集菌体，菌体用PBS洗绦一次后，用适 量的PBS重悬，加入等量的2X蛋白质电泳上样缓冲液，95°C加热10min，处理后的样品放 于-20°C备用。对照组空载体质粒pGEX-KG做同样处理。
[0028] ⑤采用SDS-PAGE和Western-Blot免疫学检测方法对其表达情况进行鉴定。
[0029] 4.重组蛋白的纯化
[0030] ①取大量诱导后的菌液200mL，8, 000r/min离心5min，收集所有菌体，用20mL缓冲 液重悬后，加入20yLDTT，高压破碎；
[0031] ②破碎后，样品4°C12, 000r/min离心10min，弃掉上清，沉淀用灭菌水洗涤两次， 加入19. 7mL缓冲液、0. 3mLSKL(20% )和20yLDTT，剧烈震荡后，室温静置0. 5-2.Oh;
[0032]③ 4°C，12, 000r/min离心10min，收集上清；
[0033] ④在上述上清中加入210yLPEG4000(20% )、420yL氧化性谷胱甘肽（50mmol/ L)、420yL还原性谷胱甘肽（100mmol/L)，装袋后透析3天；第一天每2h更换透析液一次， 第二天每4-5h更换透析液一次，第三天更换两次；
[0034] ⑤PEG8000浓缩至所需体积，样品于_80°C保存备用。
[0035] 实施例2单克隆抗体的制备
[0036] 1?免疫
[0037] 用纯化的重组蛋白作为抗原免疫4周龄雌性的Balb/c小鼠，每次需用免疫剂量为 0.lmg，共免疫四次，采用皮下多点注射，每次间隔14d。
[0038] 第一次免疫：纯化重组蛋白与等量的完全弗氏佐剂混匀作为抗原。
[0039] 第二、三、四次免疫：纯化重组蛋白与等量不完全弗氏佐剂混匀作为抗原。
[0040] 融合前三天的加强免疫：纯化重组蛋白作为抗原，采用腹腔注射。
[0041] 2?细胞融合
[0042] 1)SP2/0骨髓瘤细胞的制备
[0043] 将实验室冻存的SP2/0骨髓瘤细胞复苏，培养至六孔板，然后收集细胞，用0.3mL 1640基础培养基重悬，注入BALB/c小鼠背部皮下。待10~14天后小鼠背部形成肿瘤时 用颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5min，消毒皮毛。将小鼠固定于解剖盘中，无菌状态下将 肿瘤块剪下，置匀浆器中，加入5mL1640基本培养基充分研磨后，补加1640基本培养基至 10mL，静置5min，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加1640基本培养基至10mL， 重复两次。1，OOOrprn离心10min去上清，以20mL1640基本培养基重悬细胞。在另一 50ml 离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将SP2/0细胞悬液轻轻地加在分离液之上，1，OOOrpm 离心10min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，用1640基本培养基洗2遍，计数后备 用。
[0044] 2)免疫脾细胞的制备
[0045] 取加强免疫后的BALB/c小鼠一只，眼眶放血处死，收集血液并分离血清得到阳性 血清，小鼠于75%酒精中浸泡5min;将小鼠移至超净台内放在解剖板上，无菌取出脾脏，放 入匀浆器中，加入3mL1640基础培养基研磨，再补加10mL1640基础培养基，静置5min;轻 轻吸取上层液体于离心管中，勾衆器中再补加10mL1640基础培养基混勾，静置5min;如此 重复洗涤2次，1，000r/min离心10min后，弃去上清，细胞用适量164基础培养基重悬后计 数备用。
[0046] 3)饲养细胞的制备
[0047] 取未经免疫的BALB/c小鼠一只，眼眶放血处死，收集血液并分离血清得到阴性血 清，小鼠于75%酒精中浸泡5min;将小鼠移至超净台内放在解剖板上，无菌取出脾脏，放入 匀浆器中，加入3mL1640基础培养基研磨，再补加10mL1640基础培养基，静置5min;轻轻 吸取上层液体于离心管中，勾衆器中再补加10mL1640基础培养基混勾，静置5min;如此重 复洗涤2次，1，000r/min离心10min后，弃去上清，细胞用适量HAT培养基重悬后备用。
[0048] 4)细胞融合
[0049]将SP2/0骨髓瘤细胞悬液（lX107cells)与免疫脾细胞悬液（lX108cells)在 50mL离心管中混匀，补加适量1640基础培养基，l，000r/min离心10min;尽量弃去