人乳头瘤病毒l1蛋白突变体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开一种人乳头瘤病毒L1蛋白突变体，同时还提供了其制备方法，以及包 含至少一种所述突变体的药物组合物，特别是包含至少一种所述突变体的疫苗，属于生物 制药技术领域。
【背景技术】
[0002] 大量分子流行病学和分子生物学研究已经证明，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、 HPV45等高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus,简写为：HPV)在人体内持续感染是 引起宫颈癌发生的主要病因。不同人群中一系列研究已证实生殖道的HPV16、HPV18型感染 与宫颈癌的发生高度相关，较其它危险因素更密切。HPV是乳多空瘤病毒科多瘤病毒亚科的 一个无包膜的小型双链环状DNA病毒，它是乳头瘤病毒（PV)属中的一个成员，根据宿主范 围，可分成人、牛、兔、狗、马、羊、猪、鼠等乳头瘤病毒亚家族成员。其基因组含有8个开放阅 读框（0RF)和一个上游调节区（URR)，其中6个0RF编码的蛋白在病毒复制的早期表达， 称为早期蛋白；2个0RF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达，称为晚期蛋白。晚期蛋白包 括主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，与病毒的增殖有关。（deVilliersEM，Fauquet C，Broker TR，Bernard HU, zur Hausen H. Classification of papillomaviruses. Virology. 2004; 324(1): 17~ 27.)无论是原核，还是真核表达系统表达的Ll蛋白在近 生理环境中均可自发地形成稳定的五聚体，并且72个五聚体进一步自组装后形成T=7的 二十面体结构的类病毒颗粒（VLPs)。主要衣壳蛋白L1约有504个残基，分子量约为58 kDa。L1的三级结构有两个突出的结构域（Chen XS, Garcea RL, Goldberg I，Casini G, Harrison SC. Structure of small virus-like particles assembled from the Ll protein of human papillomavirus 16. Mol Cell. 2000;5 (3):557-567.)(图1): 一个 典型的"果冻卷" 折叠桶，包含Ll多肽链的残基20-382 ;hl_h5为5个a -螺旋，包含残 基383-475。5个等同的L1亚基形成一个五聚体（图2)在五聚体壳粒里，每个L1亚基的 a-螺旋4 (h4,残基414-429)形成突出的亚结构域后，离开它们所属的五聚体向外延伸， 并侵入邻近五聚体的L1的a -螺旋2和3 (h2和h3)里。a -螺旋5 (h5)与短的0 J股 段一起锁定邻近亚基羧基端的侧面突出部分，加强了五聚体内的联系。从T=7晶体结构可 知，a -螺旋h2、h3和h5的缺失，影响五聚体形成；h4的缺失，影响VLPs的形成，但不影响 五聚体的形成。
[0003]目前，已知的HPV有100多种亚型，由于HPV具有种属特异性，且不能在体外细胞 培养，要获得该病毒的特异性抗原，只能用重组DNA技术的方法制备基因工程疫苗。重 组L1或L1/L2在体内可自组装形成病毒样颗粒VLPs，该颗粒直径约55nm，无病毒DNA，安全 性好，具有和天然病毒颗粒相似的抗原表位，刺激机体后可产生中和抗体IgG和IgA，因此 HPVVLPs可作为预防性疫苗，从而避免因感染HPV导致产生相关肿瘤的可能性。 目前，HPV疫苗制备技术已逐渐趋于成熟，但是还存在许多问题。主要有以下几个 方面：（1)由于80%的宫颈癌发生在发展中国家和较贫困地区，因此改善疫苗制备工艺， 降低生产成本显得尤为重要。（2)据WHO统计，每年全球大约有47万例新发宫颈癌病例， 到目前为止尚无逆转已经发生的感染和已经存在的病灶得以消除的有效办法。尽快研制出 治疗和兼有预防治疗双重作用HPV疫苗时不以待。（3)致病的HPV种类很多，目前已分离 出HPV型别中有三十多种致癌。（DellG,GastonK,Humanpapillomavirusesandtheir roleincervcalcaner.CellMolLifeSci. 2001; 58(12-13): 1923-1942.)因为HPV 的种属特异性，因此，目前已有的无论是二价还是四价疫苗都不能抵挡所有型别的HPV感 染。有研究表明L2可以诱导交叉性中和抗体的产生，这或许能够为研究具有交叉保护作用 的商效疫苗提供思路。
[0004] 选择适宜的载体表达系统是研制HPV疫苗的重要环节，也是影响表达水平及蛋白 活性的关键步骤。理想的载体应具有稳定的无毒表型，不与宿主染色体发生整合，能有效表 达具有免疫原性的外源基因序列，接种后不会在宿主体内长期留存的特点。HPV疫苗研究 中应用较多的是酵母菌、昆虫细胞以及哺乳动物细胞表达系统，但其稳定性差、造价高，不 利于其在发展中国家的推广使用。而最初的HPVL1和L2衣壳蛋白是在原核细胞--大肠 杆菌中表达成功的，原核生物容易培养，表达量高，成本低，但容易形成包涵体，需要经过复 杂的变性和复性处理才能恢复蛋白质的高级结构，VLPs产率很低。因此，在大肠杆菌体系 中，提高VLPs产率可以有效地降低HPV疫苗的生产成本。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种人乳头瘤病毒L1蛋白的突变体。
[0006] 本发明另一个目的是提供所述突变体的制备方法，以及包含至少一种所述突变体 的药物组合物，特别是包含至少一种所述突变体的疫苗。
[0007] 本发明提供一种人乳头瘤病毒L1蛋白的突变体，其特征在于:人乳头瘤病毒L1 蛋白C末端a-螺旋5FPLGRKFL*LQAG中的亮氨酸L*突变成丙氨酸A或丝氨酸S，优选突 变为丙氨酸A。
[0008] 本发明所述的人乳头瘤病毒L1蛋白的突变体，其特征在于：所述人乳头瘤病毒 L1 蛋白是指 6、11、16、18、31、33、34、35、39、45,51、52、53、56、58、59、66、67、68、70、72、73 或 82、85、97型HPV中一种和/或几种的组合。
[0009] 本发明还提供编码该蛋白突变体的多核苷酸基因片段(如SEQNO. 2、SEQN0. 3、 SEQNO. 5)、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该蛋白突变体形成的 HPVL1蛋白五聚体。
[0010] 本发明另一个目的是包含至少一种所述突变体的药物组合物，具体的说，药物组 合物的有效成份为由该蛋白突变体形成的HPVL1蛋白五聚体。
[0011] 本发明第三方面是涉及包含至少一种所述突变体的疫苗，具体地说疫苗由抗原和 药物佐剂制成，该抗原主要包括由上述突变体蛋白形成的HPVL1五聚体。
[0012] 本发明所述的人乳头瘤病毒L1蛋白突变体的五聚体的制备方法，包括以下步骤： 1、 以N端去掉4个氨基酸、C端去掉29个氨基酸的截短野生型人乳头瘤病毒HPV16L1 (简称：16WT)和HPV18L1 (简称：18WT)基因序列为模板，设计带有突变位点的寡聚脱氧核 糖核酸(引物)，利用聚合酶链式反应（PCR)技术，对含有突变位点的核苷酸片段进行扩增； 2、 以pGEX-6p-l为载体片段，将突变体核苷酸片段连接于载体的多克隆位点上（BamH I和NotI)，并将重组载体转化入宿主细胞（E.coli，DH5a)中进行重组子的筛选； 3、 获得重组载体后，以XA90 (E.coli)为表达宿主细胞进行突变体蛋白的表达； 4、 利用亲和层析以及体积排阻色谱纯化L1蛋白突变体的五聚体，用SDS-PAGE蛋白质 凝胶电泳和蛋白免疫印迹法确定得到的蛋白是L1蛋白突变体的五聚体。
[0013] 本发明与对应的16WT，18WT相比，所述突变体HPV16L1L469A(简称：L469A)、HPV 16L1L469S(简称：L469S)和突变体HPV18L1L470A(简称：L470A)得到的可溶性五聚体 (正确折叠的L1蛋白）在可溶性蛋白总量中的比例均显著增加，并且突变体L1蛋白五聚体 可以进一步组装成类病毒颗粒VLPs，大小53nm左右，与野生型HPV病毒颗粒相似。其中，突 变体L469A和L470A的蛋白表达产量和可溶性五聚体的蛋白产量均有所提高，其可溶性五 聚体的产量大约是野生型的2倍(即突变体VLPs产量是野生型的2倍)。
[0014] 在本发明中，把HPVL1蛋白C末端a-螺旋5 "FPLGRKFL*LQAG"中的亮氨酸L*突 变成更亲水性的丙氨酸（Ala，A)或丝氨酸（Ser，S)后，明显提高了L1蛋白可溶性五聚体的 产率和由其组装成的类病毒颗粒VLPs的产率，从而有效地降低HPV疫苗的生产成本。比较 HPV6、11、16、18、31、33、34、35、39、45,51、52、53、56、58、59、66、67、68、70、72、73 或 82、85、 97型L1蛋白的h5序列（图3)，在h5中的亮氨酸L*这一点是高度保守的，说明在h5中的 这一点在L1蛋白结构和功能上具有重要的作用，并且这一点突变具有普适性，因而可以推 广到所有HPV型别中，这些突变为第二代廉价、广谱HPV疫苗的研发提供方案和可行性。
[0015] 本发明的积极效果在于： 在原核细胞大肠杆菌中，把HPVL1蛋白C末端a-螺旋5FPLGRKFL*LQAG中的亮氨 酸L*突变成更亲水性的丙氨酸(Ala，A)或丝氨酸（Ser，S)后，明显提高了L1蛋白可溶性 五聚体的产率和由其组装成的类病毒颗粒VLPs的产率，从而有效地降低HPV疫苗的生产成 本。
[0016]
【附图说明】： 图1是HPV16的亚基L1结构。
[0017] 图2是HPV16的L1五聚体结构示意图。
[0018] 图3是25个不同HPV型别的L1蛋白a-螺旋5 (h5)序列对比图。
[0019]图4是HPV16L1U8L1突变体核苷酸片段的扩增。
[0020] 图5是HPV16L1、18L1突变体质粒及BamHI/NotI双酶切鉴定重组DNA片段。
[0021] 图6是截短野生型16WT及其突变体L469A、L469S的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳 图。
[0022] 图7是截短野生型16WT及其突变体L469A、L469S的蛋白免疫印迹法 (Western-blot)鉴定图。
[0023] 图8是截短野生型16WT及其突变体L469A、L469S的体积排阻色谱图。
[0024] 图9是截短野生型18WT及其突变体L470A的体积排阻色谱图。
[0025] 图10是截短野生型16WT及其突变体L469A的⑶光谱图。
[0026] 图11是通过动态光散射（DLS)分析组装后类病毒颗粒VLPs粒径大小及分布，粒 径大小是53nm左右。
[0027] 图12是HPV16L1L469A突变体组装成类病毒蛋白颗粒VLPs的TEM图。
[0028] 图13是免疫后的小鼠血清中中和抗体滴度图。
[0029]
【具体实施方式】： 以下实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原 则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范 围。
[0030] 实施例1.突变体基因片段的构建 分别以含有截短野生型16WT、18WT基因片段的载体