识别具有降低免疫原性的抗体的方法

文档序号:8385097阅读:714来源:国知局
识别具有降低免疫原性的抗体的方法
【专利说明】识别具有降低免疫原性的抗体的方法
[0001] 巧关申请案帘叉参考
[0002] 本申请案根据35U.S.C. § 119(e)主张优先权主张对2012年9月19日提出申请 的临时申请案系列第61/703, 170号的优先权,其内容的全文W引用方式并入本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本申请案含有已WASCn格式通过EFS-Web提交且由此全文W引用方式并入本文 中的序列表。在2013年9月17日创建的所述ASCII副本名为381493-721W0(118133)_ 化.txt且大小为6, 980字节。
【背景技术】
[0005] B细胞表位是由免疫系统的抗体鉴别的分子位点。治疗蛋白中B细胞表位的识别 可用于设计在投与患者时不会引发免疫反应的变体。
[0006]B细胞表位可通过通常利用丙氨酸(丙氨酸扫描)使蛋白质的氨基酸个别突变并 测定各突变对抗体结合的效应来识别(翁达的nda)等人,2011,国家科学院院刊(Proc. 化tl.Acad.Sci.) 108(14) : 5742-7)。诱变后破坏蛋白质-抗体结合指示突变残基是由抗 体鉴别的B细胞表位的一部分。已发现,B细胞表位中的单一突变甚至可消除与一组针 对蛋白质的抗体的结合,并且可通过在B细胞表位中引入突变来降低蛋白质的免疫原性 (永田(^gata)和派斯坦(Pastan), 2009,高级药物递送综述(AdvancedDrugDelivery Reviews)61:977-985)。然而,此方法还耗时且劳动密集。此外,丙氨酸扫描不一定会识别 可最大降低免疫原性的突变。
[0007] 因此,需要容许识别并消除B细胞表位的简单的非劳动密集但全面的方法。

【发明内容】

[0008] 本发明提供允许对要阐明的参考抗体中所关注区域内的每一氨基酸的免疫原性 贡献的系统。本发明提供,参考抗体的任何、一些或所有位置处的氨基酸残基可突变成其它 19个氨基酸中的一些或全部且评估所述突变对抗体免疫原性的效应。还可评估突变对抗体 的表达水平和/或与祀分子的结合的效应,从而容许识别其中消除或减少免疫原性区但其 保留有利性质(例如,适宜表达水平、与祀分子的结合)的抗体变体。因此,本发明提供降 低抗体免疫原性的方法。所述方法是基于筛选并识别与抗个体基因型抗体的结合降低的抗 体变体。与抗个体基因型抗体的结合的降低与降低的活体内免疫原性相关(例如,参见永 田和派斯坦,2009,高级药物递送综述61:977-985)。
[0009] 本发明的方法通常包含W下步骤:(a)使宿主细胞库与特异性结合到参考抗体的 抗个体基因型抗体接触,所述参考抗体是结合到祀分子的单克隆抗体,所述宿主细胞库包 含各自在细胞表面上表达与参考抗体相差单一氨基酸点突变的抗体变体的哺乳动物宿主 细胞;化)识别所述宿主细胞库中表达抗体变体的细胞群体,所述抗体变体展示相对于参 考抗体降低的与抗个体基因型抗体的结合;和(C)识别在所述群体中富集的抗体变体,由 此识别具有降低免疫原性的参考抗体变体。在某些方面中,所述方法需要对宿主细胞库进 行流式细胞计数法和使用(例如)英光活化细胞分选(FAC巧从宿主细胞库分选所述群体。
[0010] 在某些方面中,所述方法进一步包含W下步骤:测定具有降低免疫原性的抗体变 体是否W实质上等于或优于参考抗体的水平结合到祀分子和/或W实质上等于或优于参 考抗体表达水平的水平表达。在具体实施例中,结合和表达是通过流式细胞计数法、磁性珠 粒分选、BIAcore、FACS、ELISA、AlphaLisa或Ki址xA测定,并且是在识别具有降低免疫原性 的抗体变体之前、同时或之后测定。
[0011] 本文所述方法已适用于抗TNF-a抗体D2E7 (还称作阿达木单抗(Adalimum油))。 识别与1个、2个或3个不同抗个体基因型抗体的结合降低的D2E7变体。本发明提供具有 与D2E7的CDR序列相关的CDR序列的抗TNF-a抗体,但其具有至少一个降低与抗Id抗体 的结合的取代。所述变体在本文中有时称作"降低免疫原性"变体。
[0012] 本发明的抗TNF-a抗体包含6个氨基酸序列对应于W下序列的CDR;SEQID N0:5(CDR-Hl)、WQIDN0:6(CDR-ffi)、WQIDN0:7(CDIM13)、WQIDN0:8(CDR-Ll)、WQ IDN0:9(CDR-L2)和SEQIDN0:10(CDR-册),并且具有至少一个选自W下的取代;CDR-Ll 中的G5F、CDR-L1 中的G5I、CDR-L1 中的G5V、CDR-L1 中的G5W、CDR-L1 中的G5Y、CDR-L1 中 的R7I、CDR-L1 中的R7T、CDR-L1 中的R7V、CDR-L1 中的N8A、CDR-L1 中的N8D、CDR-L1 中 的N8E、CDR-L1 中的N8G、CDR-L1 中的N8L、CDR-L1 中的N8M、CDR-L1 中的N8Q、CDR-L1 中 的N8R、CDR-L1 中的N8T、CDR-L2 中的All、CDR-L2 中的A1T、CDR-L2 中的A1V、CDR-L2 中 的T4D、CDR-L3 中的R2G、CDR-L3 中的MF、CDR-L3 中的N4M、CDR-L3 中的N4W、CDR-L3 中 的MY、CDR-L3中的贴L、CDR-L3中的贴N、CDR-L3中的贴W、CDR-L3中的贴Y、CDR-L3中 的T9Y、CDR-H1 中的D1S、CDR-H1 中的Y2A、CDR-H1 中的Y2C、CDR-H1 中的Y2K、CDR-H1 中 的Y2M、CDR-H1 中的Y2R、CDR-H1 中的Y2S、CDR-H1 中的Y2V、CDR-H1 中的册C、CDR-H1 中 的册D、CDR-H1中的册E、CDR-H1中的册S、CDR-H1中的册T、CDR-肥中的T3A、CDR-肥中 的T3G、CDR-肥中的T3N、CDR-肥中的W4A、CDR-肥中的W4F、CDR-肥中的W4H、CDR-肥中 的W4L、CDR-肥中的W4M、CDR-肥中的W4V、CDR-肥中的N5G、CDR-肥中的S6D、CDR-肥中的 S化、CDR-肥中的I9K、CDR-肥中的D10L、CDR-肥中的Y11A、CDR-肥中的Y11C、CDR-肥中 的Y11EXDR-肥中的Y11FXDR-肥中的Y11GXDR-肥中的Y11HXDR-肥中的Y11IXDR-肥 中的YUK、CDR-H2 中的Y11L、CDR-H2 中的Y11M、CDR-H2 中的Y11N、CDR-H2 中的Y11Q、 CDR-H2 中的Y11R、CDR-H2 中的Y11S、CDR-H2 中的Y11V、CDR-H2 中的Y11W、CDR-H2 中的 A12YXDR-H2 中的D13NXDR-H2 中的V15DXDR-H2 中的V15UCDR-H2 中的V15MXDR-H2 中 的V15QXDR-肥中的V15TXDR-肥中的E16FXDR-肥中的E16HXDR-肥中的E16KXDR-肥 中的E16R、CDR-H2 中的E16T、CDR-H2 中的E16W、CDR-H2 中的G17A、CDR-H2 中的G17C、 CDR-H2 中的G17E、CDR-H2 中的G17H、CDR-H2 中的G17I、CDR-H2 中的G17K、CDR-H2 中的 G17UCDR-H2 中的G17MXDR-H2 中的G17NXDR-H2 中的G17PXDR-H2 中的G17QXDR-H2 中 的G17R、CDR-肥中的G17S、CDR-肥中的G17T、CDR-肥中的G17Y、CDR-册中的V1G、CDR-册 中的V1R、CDR-H3 中的V1W、CDR-H3 中的L4T、CDR-H3 中的L4V、CDR-H3 中的T6V、CDR-H3 中 的S9KXDR-册中的S9WXDR-册中的S9Y和CDR-册中的D11V。与阿达木单抗的CDR序列 相比,6个CDR总共可具有至多8个、至多7个、至多6个、至多5个或至多4个氨基酸取代。 在某些方面中,与阿达木单抗的CDR相比,各CDR可具有至多4个、至多3个或至多2个取 代。在具体实施例中,本发明的抗TNF-a抗体具有氨基酸取代的一或多个组合,其中重链 取代(如果存在)包含W下中的至少一者;(a)CDR-Hl中的Y2K;(b)CDR-Hl中的Y2M;(c)CDR-H1中的Y2K和CDR-册中的T6V; (d)CDR-H1中的Y2KXDR-册中的V1G和CDR-册中的 T6V;(e)CDR-册中的V1W;和(f)CDR-册中的V1G和CDR-册中的T6V,并且其中轻链取代 (如果存在)包含W下中的至少一者;(a)CDR-L1中的G5S和CDR-L1中的A11S;化)CDR-L1 中的R7I; (C)CDR-L1 中的G5S、CDR-L1 中的R7T和CDR-L1 中的Alls;和(d)CDR-L1 中的 G5SXDR-L1中的R7I和CDR-L1中的Alls。在具体实施例中,本发明抗体包含选自图22中 所述氨基酸取代的氨基酸取代的组合。
[0013] 本发明的抗TNF-a抗体优选与阿达木单抗抗个体基因型抗体5A1、10F8、7A11、 mil、6All和10B7中的一者、二者、H者、四者、五者或所有六者的结合降低。
[0014] 本发明进一步涉及编码本发明的抗TNF-a抗体的核酸分子和包含其的宿主细 胞。
[0015] 本发明进一步涉及包含本发明的抗TNF-a抗体的医药组合物和通过投与抗 TNF-a抗体或含有其的医药组合物治疗患有免疫病症的人类患者的方法。在某些方面中, 所治疗免疫病症是类风湿性关节炎(RA)(包括成人的中度到严重RA)、青少年型特发性关 节炎(JIA)(包括4岁和更大年龄患者的中度到严重多关节JIA)、银屑病关节炎(PsA)(包 括成人的PsA)、关节粘连性脊椎炎(A巧(包括成人的AS)、克罗恩氏病把rohn'sdisease) (CD)(包括成人的中等或严重CD)、慢性斑块状银屑病(Ps)(包括成人的中度到严重慢性斑 块状银屑病)或轴也型脊椎关节炎(axSpA)(包括无结构损害的X射线证据的成人患者的 严重axSpA)。
【附图说明】
[0016] 图1A-1C;图1A提供合成D2E7 (阿达木单抗,HUMIRA)可变重链(Vh)和可变轻链 (V^片段的翻译氨基酸序列。图1B提供0267¥?和V^片段的CDR氨基酸序列。图1C提供 D2E7Vh和D2E7Vl片段的核巧酸序列(分别为SEQIDN0:1和SEQIDN0:3)。
[0017] 图2 ;提供D2E7-Vl中引起与TNF-a的中性结合和与抗Id5Al(a)、10F8(b)或 7All(c)的降低结合的有益突变列表。给出在个别CDR和在卡己特化abat)编号两种情况 下的氨基酸位置。图2按出现顺序分别掲示SEQIDNO. :8-10。
[001引 图3A-3B;图3A提供D2E7-VhCDR-H1和CDR-肥中将引起与TNF-a的中性 结合和与抗IdlHll(d)、6All(e)或10B7(f)的降低结合的有益突变列表。图3B提供 D2E7-VhCDR-H3中引起与TNF-a的中性结合和与抗IdlHll(d)、6All(e)或10B7讯的降 低结合的有益突变列表。给出在个别CDR和在卡己特编号两种情况下的氨基酸位置。图3A 按出现顺序分别掲示SEQIDNO. :5-6。图3B掲示SEQIDN0:7。
[0019] 图4提供载体pYA206和pCWeOO中的D2E7的结构。
[0020] 图5提供人类TNF-a对细胞表面表达的WTD2E7F油的滴定曲线。
[0021] 图6提供结合到细胞表面表达的WT-D2E7F油的抗个体基因型(抗Id)的滴定曲 线。
[0022] 图7A-7B;图7A提供经TNF-a染色的野生型D2E7的FACS分选概况。图7B提供 经TNF-a染色的Vh点突变库的FACS分选概况。
[002引图8A-8B提供经1H11染色的野生型D2E7和Vh点突变库的FACS分选概况。
[0024] 图9提供沉默密码子突变D2E7富集比(W位置计)。给出在个别CDR情况下的氨 基酸位置。
[0025] 图10提供D2E7子库的板图。给出在个别CDR和在卡己特编号两种情况下的氨基 酸位置。图10按出现顺序从顶部到底部,从左到右分别掲示SEQIDNO. :8-10和5-7。
[0026] 图11提供D2E7突变体子库和野生型对照的FACS概况。
[0027] 图12提供D2E7突变体子库和野生型对照的FACS概况。
[002引图13A-13D提供D2E7重链可变区的空间填充模型。图A、B和C分别W灰色显示 轻链CDR1、2和3。图DW灰色显示抗Id抗Id1H11的表位。如下文所绘示Vh序列(SEQ IDN0:2)显示加下划线的CDR和W粗体双下划线文本表示的对于与抗Id1H11的结合重要 的位置。H个CDR中的各者都向所述表位贡献一或多个氨基酸。
[0029] EVQLVESGGGLVQPGR化化SCAASGFT抑ax:昼旦'WVRQAPGKGLEWVSAIT巡NSGHIDYADS 哩^RFTIS畑NAKNSLYLQMN化RAEDTAVYYCAK里进 ^STASSLDYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO: 2)
[0030] 图14A-14D提供D2E7轻链可变区的空间填充模型。图A、B和C分别W灰色显示 轻链CDR1、2和3。图DW灰色显示抗Id5A1和10F8的表位。如下文所绘示列(SEQ IDN0:4)显示加下划线的CDR和W粗体双下划线文本表示的对于与抗Id5A1和10F8的结 合重要的位置。H个CDR中的各者都向所述表位贡献一或多个氨基酸。
[0031] DIQMTQSPS化SASVGDRVTITCRASQGIRNYI,AWYQQKPGKAPKU,TYAASIIQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTIS化QP邸VATYYC皿I狂RAPYTFGQGTKVEIK(SEQIDNO:4)
[003引 图15提供D2E7-VhCDRl-2突变体的单点FACS分析。
[0033] 图16提供D2E7代表性位置分析。
[0034] 图17提供平均1H11富集比(W位置计)。
[0035] 图18提供平均5A1富集比(W位置计)。
[0036] 图19提供平均10F8富集比(W位置计)。
[0037] 图20A-20B显示抗TNF-a抗体突变对与四个市售供体的血清试样中的抗阿达木 单抗抗体的结合的影响。氨基酸位置是W卡己特编号给出。VkSS是指CDR-L1中具有取代 G28S和A34S(卡己特编号)的化,其对应于CDR-L1中的G5S+A11S组合。
[0038] 图21A-21B显示与抗阿达木单抗抗体的结合的降低最大的抗TNF-a变体抗体。 VkSS是指CDR-L1中具有取代G28S和A34S(卡己特编号)的化,其对应于CDR-L1中的 G5S+A11S组合。
[0039] 图22显示具有多个氨基酸取代的变体的结合数据。VkSS是指CDR-L1中具有取 代G28S和A34S(卡己特编号)的化,其对应于CDR-L1中的G5S+A11S组合。
【具体实施方式】
[0040] 识别具有陈化免疫原巧的杭体的方法
[0041] 本发明进一步提供允许对要阐明的所关注抗体(参考抗体)内所关注区域中的每 一氨基酸的免疫原性贡献的系统。所述方法需要对参考抗体在一或多个区(例如,CDR-L1、 CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-肥、CDR-册、FR-L1、FR-L2、FR-L3、FR-H1、FR-肥、FR-册和 FR-H4中的一或多者)进行全面诱变和评估突变对与抗个体基因型抗体("抗Id")的结合 的效应。本文所述方法可识别上述具有降低免疫原性的抗TNF-a抗体变体。
[0042]库设计和构筑:设计抗体库,其在参考抗体的所需区或结构域中的每一可能位置 处含有每一可能单一氨基酸取代,用于识别突变对与抗Id抗体的结合的效应(良好、差或 中性)。随后使用(例如)"随机化NNK密码子"构筑抗体变体库W产生单一氨基酸变体, 其中"N"是指任何碱基(例如,A、C、G或T)且"K"是指G或T。NNK随机化方案可编码覆 盖所有20种天然氨基酸的32个不同密码子。抗体的各位置处的氨基酸残基可突变为与 相同位置处的野生型氨基酸不同的19种氨基酸中的任一者,从而在抗体中产生单一氨基 酸点突变。最终结果是抗体变体库,其涵盖有一个残基在库中成员之间各有不同的多种抗 体的群组。基于祀向突变的氨基酸数目,库的总体复杂性可介于约50-10, 000个成员之间 (例如,50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、 7000、7500、8000、8500、9000、9500 或 10, 000 个成员),介于约 1000-5000 个成员之间,或为 约1000个成员。与库的大小和复杂性无关,本文所述方法容许同时筛选库的所有成员并同 时对其进行测序。
[0043] 作为非限制性实例,为识别与参考抗体相比具有降低免疫原性的特定抗体变体, 互补决定区(CDR)中的氨基酸残基是潜在突变祀。B细胞表位的消除或减少可产生具有降 低免疫原性的抗体。通常,可考虑并识别约50到60个CDR氨基酸位置用于突变。可设计 并构筑合成DNA片段组,其编码野生型亲代Vh或V許日所有可能的单一氨基酸抗体变体。可 使用上述随机化NNK密码子产生单一氨基酸抗体变体。因此,CDR内各位置处的氨基酸残 基可突变,从而沿所选CDR区产生单一氨基酸点突变。最终结果是抗体变体库,其是有一个 残基在库中成员之间各有不同的多种抗体的群组。在此实例中,库具有约1000-1300个成 员,其中所选区中的50到60或65个CDR氨基酸位置中的各者经19种天然氨基酸中的一 者取代,在任何给定位置处总共20种不同氨基酸(即,50X20 = 1000 ;60X20 = 1200 ;或 65X20 = 1300)。
[0044]抗体变体的表达;在库构筑后,第二步骤是表达抗体变体库用于通过细胞表面展 示来分选。可使用基于展示的方法(例如瞻菌体展示、酵母展示、细菌展示和核糖体展示) 表达变体库,并且优选地在哺乳动物细胞中表达W确保所表达变体进行适当折叠和翻译后 修饰。
[0045] 对于哺乳动物表达来说,用于在细胞表面上系留并展示四聚体免疫球蛋白分子的 跨膜结构域可为能够经由酶、化学或光解裂解移除的任何跨膜结构域。在一些实施例中, 跨膜结构域侧接由裂解酶鉴别并裂解的裂解位点。举例来说,裂解酶可为脂肪酶、醋酶、磯 酸酶、糖巧酶或駿肤酶。在一些实施例中,跨膜结构域包含具有核酸酶(例如核糖核酸酶 (RNase)或脱氧核糖核酸酶值化se))鉴别并裂解的序列的寡核巧酸或寡核巧酸类似物。在 一些实施例中,跨膜结构域包含蛋白酶鉴别并裂解的肤或肤类似物。
[0046] 在一些实施例中,可使用mRNA剪接产生具有或无跨膜结构域的免疫球蛋白(例 女口,参见美国专利第7, 947, 495号,其全部内容都W引用方式并入本文中)。
[0047] 在其它实施例中,跨膜结构域侧接由重组酶鉴别的重组酶鉴别位点。重组酶鉴 别位点的实例包括(但不限于)lox位点、att位点、dif位点和化t位点。关于重组酶的 综述参见(例如)索尔(Sauer) ,1994,生物技术新见(Qirr.Opin.Biotech.) 5:521-527; 兰迪(Landy),1993,生物技术新见 3:699-707 ;萨多夫斯基(Sadowski),1993,FASEB 7:760-767 ;和美国专利公开案第20040115814号。
[0048] 用于本文所述组合物和方法中的跨膜结构域可源自I型、II型和III型 膜蛋白(例如,参见切斯纳特(Chesnut)等人,1996,免疫学方法杂志(J.Imm. Methods),193:17-27 ;瓦尔贝里(W址化erg)等人,1997,细胞生物学杂志(J.Cell Biol. ),137:555-562;廖(Liao) ,2001,生物技术与生物工程炬iotech.and Bioeng. ),73:313-323 ;和美国专利第5, 264,
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