基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境保护的水处理领域，特别是涉及一种消毒技术对污水中抗生素抗 性基因的净化方法。
【背景技术】
[0002] 抗生素抗性基因（Antibtiotics Resistance Genes，ARGs)是一种新型污染物，城 市污水处理厂作为ARGs的重要储存场所，其出水也是ARGs排入水环境中的重要污染源，控 制污水处理厂出水中ARGs对减少环境中ARGs污染，降低ARGs的生态风险具有重要意义。
[0003] 消毒技术是处理城市污水中病原微生物，保证污水安全排放及回用的重要工艺 段，常用的消毒工艺有氯消毒、UV、臭氧消毒。现有关于污水厂中氯化、UV消毒对ARGs的去 除影响的报道多集中于对污水处理厂水样进行直接的监测，相关的氯化、UV剂量等操作参 数并不明确。
【发明内容】
[0004] 本发明为了解决去除污水中的抗生素抗性基因的问题，提供了一种基于消毒技术 去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体考察了 UV、氯化联合消毒工艺对污水中ARGs去除 的影响。
[0005] 解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006] 基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，采用紫外和氯化 联合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下：
[0007] (1)水样预处理
[0008] 采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中；
[0009] ⑵消毒
[0010] 在室温下，将上述步骤（1)采集的水样分别进行紫外光照15s、3〇S，则UV剂量分别 为62mJ/cm 2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaCIO使游离氯分别达到5、20、40mg/L，使用搅拌 器搅拌，反应120min后加入1. 5%的Na2S203以终止反应；
[0011] ⑶膜过滤
[0012] 取200mL上述步骤（2)的水样，用0. 22 ym混合纤维滤膜过滤；过滤后保留滤膜并 置于50%乙醇中于-20°C保存以待后续的DNA提取以及随之的基因定量；
[0013] ⑷DNA提取
[0014] 将富集微生物的膜剪碎，提取DNA ;
[0015] (5)定量 PCR
[0016] 使用实时定量聚合酶链式反应PCR法对四环素类抗性基因tetX、tetG、磺胺类抗 性基因sul、l型整合子编码基因intll及16S rDNA作出定量，所述的定量步骤包括：a)配 制PCR反应体系溶液；b)使用PCR扩增仪进行扩增；c)PCR后产物进行琼脂糖凝胶电泳；d) 测定PCR产物浓度；
[0017] (6)检测抗生素抗性基因ARGs的含量并分析结果。
[0018] 优选地，所述的紫外消毒采用有机玻璃制成的圆柱形光化学反应器，圆柱形光化 学反应器中间竖直放置石英套管，石英套管内放置紫外灯，石英套管外壁254nm处的紫外 光强为9. 85mW/cm2,紫外线有效剂量为4. 159mW/cm2。
[0019] 优选地，所述的NaCIO的有效氯彡8%。
[0020] 优选地，所述的DNA提取具体步骤如下：
[0021] a)将滤膜在室温下解冻并剪碎加入裂解管E管中；
[0022] b)向上述管中加入978 y L磷酸钠缓冲液，及122 y L MT Buffer ;
[0023] c)将E管放在FastPr印中以速度为6. Om/s振荡40s。随后将E管放置在离心机 中以 14000 X g 离心 lOmin;
[0024] d)离心后，将上清液转移新的2mL离心管中，加入250 y L蛋白沉淀溶液，手摇10 次离心管混合溶液；
[0025] e)将离心管放入离心机以14000Xg离心5min，将上清液转移至15mL离心管，并 加入lmL DNA结合溶液，促进DNA与硅胶结合，将离心管上下颠倒2min，随后将离心管放至 在架子上静置3min;
[0026] f)小心去除500 y L的上清液，重新悬浮剩余的混合液；转移约600 y L的混合液 到含SPIN?Filter的管中，以14000Xg离心lmin;接着将SPIN?Filter管中的液体倒掉； 重复上述过程直到剩余混合液全部转移离心完；
[0027] g)加入500 y L SEWS-M，溶解和清洗DNA至SPIN?Filter管中，用移液枪吹打使沉 淀物重新悬浮后以14000Xg离心lmin ;将SPIN?Filter管中的液体倒掉，再以14000Xg 离心2min，去除基质中的SEWS-M;
[0028] h)将SPIN?Filter放到新的Catch Tube中，于室温下风干5min后加入80yL DES，用移液枪枪头在滤膜上轻轻搅动，使滤膜上的沉淀物重新悬浮后以14000Xg离心 lmin，DNA 则转移至 Catch Tube 中；
[0029] i)将提取的DNA于-20°C或在4°C保存，用于接下来的PCR扩增及其他步骤。
[0030] 优选地，所述的PCR反应体系溶液为25yL，包括：2. 5yL 10XPCR缓冲液，2yL 皿8(：12,2 1^(1阶13混合剂，上下引物各0.2 1^，0.125 1^￡叉丁39〇嫩聚合酶，2 1^0嫩模 板，即提取的DNA稀释至约20ng/ y L，及ddH20使体系至25 y L。
[0031] 优选地，使用PCR扩增仪进行扩增，反应温度程序为94°C变性5min后进入35个循 环，每个循环中，先在94°C反应45s，随之在退火温度下反应45s，之后在72°C下反应90s，循 环反应之后再于72°C下反应lOmin，实验中ARGs的扩增效率在90%~100%之间，标曲相 关系数R 2均大于0.99。
[0032] 优选地，PCR后产物进行琼脂糖凝胶电泳，以观测是否有目标ARGs的扩增产物，对 于含有目标ARGs的PCR产物进行纯化，后进行质粒制备。
[0033] 优选地，琼脂糖凝胶电泳的具体步骤为：
[0034] 称取0.3g琼脂糖于锥形瓶中，加入1XTAE 30mL，加热炉加热琼脂糖，加热均匀后 待溶液冷却至30°C左右时向溶液中加入2 y L溴化乙锭，随后将溶液倒入胶床内，插入梳 子，放置60min左右待凝胶固化。将凝胶放入电泳槽中，加入1 X TAE溶液，使溶液没过凝胶 l-2mm。将1 y L Loading Buffer与5 y L的PCR产物混合均匀，加入凝胶中上样孔中。盖 上泳槽，接通电源，在100V电泳25min，电泳结束后，取出凝胶在凝胶成像仪上观测结果。
[0035] 优选地，PCR产物纯化具体步骤为：
[0036] a)在PCR产物溶液中，加入3倍产物体积Buffer PCR-A，混匀后转移至PCR制备 管，将PCR制备管置于提供好的2mL离心管中，以12000Xg离心lmin，并弃掉滤液；
[0037] b)将 PCR 制备管置回 2mL 离心管，加 700 yL Buffer W2,以 12000Xg 离心 lmin， 弃滤液。随后加入400 yL Buffer W2,以12000Xg离心lmin;
[0038] c)将制备管置于1. 5mL洁净离心管，在制备管膜中央加25-30 yLEluent或去离 子水，室温静置lmin，随后以12000Xg离心lmin洗脱DNA。
[0039] 优选地，使用超微量紫外分光光度计测定PCR产物浓度，计算其摩尔数：
【主权项】
1. 基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，采用紫外和氯化联 合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下： (1) 水样预处理 采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中； (2) 消毒 在室温下，将上述步骤（1)采集的水样分别进行紫外光照15s、30s，相应的UV剂量分别 为62mJ/cm2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaCIO使游离氯分别达到5mg/L、20mg/L、40mg/L， 使用搅拌器搅拌，反应120min后加入1. 5%的Na2S203以终止反应； (3) 膜过滤