鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于特异性检测和任选地定量来自于个体样品的鸟分枝杆菌亚种副 结核分枝杆菌（Mycobacterium avium spp.paratuberculosis) (MAP)的方法。为此，根据 本发明的方法，通过核酸扩增和特异性寡核苷酸来检测样品中IS900域（IS90〇region)的 存在。另一方面，本文提供了用于通过扩增方法对样品中MAP进行特异性检测的检验试剂 盒。最后，公开了适用于特异性检测MAP的特异性寡核苷酸。 现有技术
[0002] 鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium)是一种具有多种宿主的分枝杆菌种 (mycobacterium species)。一方面，鸟分枝杆菌可在禽类中引起结核病，另一方面其也是 人类和其它哺乳动物中的病原体。鸟分枝杆菌的一个种是鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆 菌（MAP),其为分枝杆菌属（genus Mycobacterium)的专性（obligate)病原菌。MAP被 视为是引起副结核病（Johne' s disease)的原因，特别是在反刍动物身上会出现该疾病。 除了反刍动物和人以外，在其它动物物种，特别是野生动物，尤其是野兔、鸟类、野猫、浣熊 和老鼠中也可能检测出MAP亚种。此外，关于该病原体在临床上可能涉及人中的"克罗恩 病"（"Crohn' s disease"）存在着讨论。
[0003] 自19世纪初就已知MAP病原体为副结核病的病原（causative agent)。副结核 病是一种慢性肠道疾病，其会在数星期的时间导致持续的体重减轻。在最后的阶段，这种 疾病会产生致命的结果。成年的家养反刍动物，如牛、绵羊和山羊，以及野生的反刍动物和 动物园动物主要会被感染。通常，病原体的传播主要发生在新生的小牛和最多6个月大的 小牛中。此处，感染大多不易察觉地发生并且通过口腔-粪便的途径无法察觉地转移，甚 至被感染的奶牛的初乳会含有病原体。在伴随无规律且不可控的病原体分泌（pathogen excretion)的几年时间的潜伏期之后，该疾病通常先在年龄较大的母牛中出现。目前还没 有治疗方法。过去，疫苗显示出了令人怀疑的结果，以至于它们目前在德国没有被使用。通 常情况下，购买亚临床上表现（subclinically)感染的或被持久性感染的动物造成了畜群 中的新感染。恰恰是临床上不显著的携带者和未识别的排菌者（excreters)是造成长期持 续的家畜感染的重要原因。正是由于副结核病的广泛分布和经济损失，目前亟需改进的诊 断方法和控制程序的开发。在德国，根据动物传染病法§ 78a 2款（§ 78a Art. 2 of the Infectious Animal Diseases Law)副结核病须予以具报。
[0004] 副结核病的诊断是控制和早期识别副结核病的重要元素。已有依赖于例如基于抗 体测试的各种测试方法和诊断方法。然而，商业上可获得的测试的一个问题是灵敏度和特 异性的不足。此外，由于因这些测试的灵敏度不够而使血清学检测（serologically)阴性 的排菌者可以保留在畜群中并因此可进一步传播疾病，基于抗体的测试是不适用的。
[0005] 为了能够在将来实施有效的根除计划，可靠的病原体检测方法是必要的。分子生 物学，特别是基于核酸扩增的方法已经常性地被讨论。特别地，基于聚合酶链式反应（PCR) 的分子生物学方法被认为是非常有前途的。PCR是用来确认疑似样品中MAP DNA的快速且 可靠的方法。这一方面，插入序列（insertion sequence) IS900以及ISMav2、hspX和F57 的域已被确定为MAP基因组中特别合适的域。插入单元IS900特别凸现为适用于（特别是 通过PCR方法的）分子诊断的域。IS900是1451bp的片段，其具有参照菌株MAP-K10的基 因组中的17个拷贝。由于这一高的拷贝数量，可以实现检测方法中更高的灵敏度并使得 IS900成为合适的靶向域。已描述了基于靶向序列IS900的检测MAP用的传统和实时PCR。
[0006] 由此，DE102007015775A1中包括了适用于特异性检测MAP的寡核苷酸。此外，该文 献公开了相应的用于检测MAP的方法和试剂盒。由EP 2 009118 A2已知有基于IS900和 F57特异性引物的检测和定量MAP用的方法。
[0007] 然而，一如既往，上述那些方法仍然存在高特异性时灵敏度不足的弱点。
[0008] Bull等人，2007，Plos One, ll，el229描述了用于检测MAP的实时PCR分析法。 Miinster P.，等人，2011，Vet Microbiol, 154 (1-2) ,197-201 公开了一种用于检测 MAP 的半 逆转录PCR(semi-rested PCR)(snPCR)。高灵敏度被描述。然而，snPCR需要两个PCR运行 的性能。已知snPCR是一种具有高污染风险的方法，因而不适合高样品通量情况下的常规 使用。
[0009] 然而，在高灵敏度和高特异性的情况下检测被感染的个体是必要的，从而能执行 适当的消灭程序（eradication program)。特别地，此方法还应当对生物样品，例如粪便、器 官、牛奶和组织样品来说是可操作的，并且无需进行大量的需要长达16周的时间或处理步 骤的预培养。
[0010] 此外，该方法应能允许适当的自动化。现有技术中描述的方法则不允许。
【发明内容】
[0011] 在一方面，本申请涉及用于在来自个体的样品中特异性检测或定量鸟分枝杆菌亚 种副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium spp.paratuberculosis) (MAP)的方法。为此， 根据本发明的方法包括通过核酸扩增在样品中检测MAP基因组的IS900域（IS90〇region) 的步骤，其中该扩增利用分别由根据Seq. IDNo.1和Seq. IDNo.2序列的至少15个连续的 核苷酸组成的特异性寡核苷酸来进行，并且至少一个MAP基因组的IS900域的检测指示了 样品中MAP的存在。
[0012] 然后发现了如本文所用的特异性寡核苷酸，即分别具有根据Seq. ID No. 1和Seq. ID No. 2的序列的至少15个连续的核苷酸的寡核苷酸，这在基于一种核酸扩增的诊断方法 中实现了针对MAP的出色的特异性和灵敏度。
[0013] 本文优选的是根据Seq. ID No. 1和/或Seq. ID No. 2的彼此独立的寡核苷酸，所述 寡核苷酸具有这两个序列的至少16个，例如17个或18个连续的，并且特别是至少19个核 苷酸。更优选的是根据Seq. ID No. 1和/或Seq. ID No. 2的特异性寡核苷酸的至少一种， 其具有所述序列的至少11、12、13、14、15个，特别是至少16、17、18、19个或全部核苷酸。清 楚的是，还包括其中一种寡核苷酸例如具有根据Seq. ID No. 1的序列的至少18个核苷酸以 及根据Seq. ID No. 2序列的至少19个核苷酸的实施方式。每一种变化均被包括在本发明 的范围内。
[0014] 所述核酸扩增方法优选为聚合酶链式反应（PCR)。其可特别为实时PCR。所述PCR 例如为实时PCR的形式，特别为定量PCR。
[0015] 相对于同样基于PCR的已知方法，使用本发明的寡核苷酸作为引物对（primer pair)，可以在一个扩增循环中获得有意义的结果。此前已知的方法往往依赖于所谓的"巢 式"（"nested"）或"半巢式PCR"（ "semi-nested PCR"）方法。在这些方法中，扩增发生 在两个步骤中，即所述方法需要较长的时间并且比单一步骤的方法更加昂贵。实时PCR的 其它优点是MAP DNA的定量的可能性、低污染风险的快速操作以及高灵敏度和特异性的保 证。
[0016] 尤其优选的是，在核酸扩增中，例如PCR，特别是实时PCR，且尤其优选地在定量 PCR中，通过核酸探针来实现IS900域的检测。这种核酸探针是通常标记有标签或标记的寡 核苷酸，所述标签或标记杂交至MAP基因组的IS900域和/或与MAP基因组的IS900域互 补的核酸。
[0017] 本文中，杂交被理解为核酸分子诸如核酸探针附着至至少一种另外的核酸分子 (此处为经扩增的基因片段），其中在附着区域两个单独的链实质上完全互补。还可在核 酸探针和存在的双链DNA之间形成三螺旋。对于本领域技术人员来说已知有公知的杂交方 法。特别地，杂交区域至少70%，例如至少75%，特别是至少80%，优选至少90%，例如至 少95 %，特别是至少99 %互补，例如完全互补。
[0018] 在一项优选的实施方式中，核酸为具有根据Seq. ID No. 3的至少15个连续的核苷 酸的寡核苷酸。优选的是，探针为具有根据Seq. ID No. 3的至少16、17或18个连续的核苷 酸的寡核苷酸，优选具有19个核苷酸，例如具有20个核苷酸的Seq. ID No. 3序列本身。 [0019] 此处，以允许用已知方法来进行简单检测的常规方式标记探针。常规的标签或标 记是本领域技术人员已知的，例如荧光染料如FAM (5-或6-羧基荧光素）、VIC、NID、荧光素、 异硫氰酸突光素（fluorescein isothiocyanate) (FITC)、6_ 羧基-2'，4'，7'，4, 7-六氯突 光素（6-carboxy_2,，4，，7，，4, 7-hexa-chlorofluorescein)，花青染料（cyanine dyes) 如Cy3，Cy5等，若丹明染料（rhodamine dyes)，菲陡染料（phenanthridine dyes)以及本领 域技术人员已知的其它染料。特别适用于探针检测的是FAM和黑洞淬灭剂-1 (black hole quencher-1)(BHQ1)。
[0020] 对于特定的核酸扩增法，例如PCR、实时PCR以及特别是定量PCR来说，合适的染料 与合适的扩增系统的结合是本