一种提高生物絮凝剂活性成分多糖产量的发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高生物絮凝剂活性成分的发酵方法。
【背景技术】
[0002] 作为水处理的核心技术，水处理材料新产品的研发一直代表了水处理技术的前 沿。絮凝剂就是核心技术中效果良好的一种，在水处理中的最普遍而又关键的絮凝阶段发 挥着重要的作用。如今的水处理中已经大规模地使用絮凝剂处理城镇生活污水、工业废水， 特别是在处理特殊废水方面也广泛应用。其中，生物絮凝剂的出现解决了传统絮凝剂不易 生物分解，容易给环境和健康带来危害等问题，并具有来源广，种类丰富，无毒性，絮凝能力 好等优点，因而越来越受到青睐。但是在实际应用中，生物絮凝剂存在产量低的问题，使生 物絮凝剂不能大批量地生产。尤其工业发酵过程复杂、不稳定的特性导致无法对发酵过程 进行预测。如何生产高效高产量的生物絮凝剂成为水处理领域研宄的热点问题，受到广泛 的关注。
[0003] 细菌能自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其浓度变化，调节微生物的 群体行为，这一调控系统称为群体感应（Quorum Sensing，QS)。根据QS理论，每个细胞都会 不间断的合成信号分子，当信号分子浓度达到阈值时会引发相关基因的表达以适应环境条 件的变化。革兰氏阴性菌的主要QS信号分子为N-酰基高丝氨酸内醋（N-acyl-homoserine lactone，AHL)。研宄发现，AHLs能影响一些菌株的多糖合成、表面活性、生物膜的形成 等，有研宄表明Rhizobium meliloti的胞外多糖受ExoS-Chvl群体感应系统调控，而 Sinorhizobium meliloti瑭泊酰聚糖的合成受到ExpR/Sin群体感应系统的调控。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种提高生物絮凝剂活性成分多糖产量的发 酵方法，该方法提高生物絮凝剂主要活性物质成分一多糖的浓度，从而提高生物絮凝剂的 活性，简单、快捷、效果明显。用于生物絮凝剂的生产中，能提高有效活性成分的含量。
[0005] 为实现本发明目的，提供了以下技术方案：
[0006] 一种提高生物絮凝剂活性成分多糖产量的发酵方法，它是按照以下步骤操作的： 首先将生物絮凝剂产生菌接种至絮凝发酵液体培养基中，发酵制备种子液；然后将种子液 接种于投加了外源AHLs的絮凝发酵液体培养基中，进行二次发酵，即制得生物絮凝剂，完 成所述的提高生物絮凝剂活性成分多糖产量的发酵；其中，外源AHLs为N-3-氧-辛酰高丝 氨酸内酯、N-己酰高丝氨酸内酯中的一种或两种按任意比混合；其中，投加了外源AHLs的 絮凝发酵液体培养基为将外源AHLs加入到絮凝发酵液体培养基中至外源AHLs的终浓度为 0. 1 yM ~0. 5 yM。
[0007] 本发明包含以下有益效果：
[0008] 采用本发明的方法，表明外源AHLs的投加可以提高生物絮凝剂中活性成分多糖 的浓度和絮凝活性，提高了生物絮凝剂的絮凝效果。其中，投加〇. 4 y M外源C6-HSL时，发酵 液中多糖浓度达到最高，与对照组相比提高了 1. 6倍，絮凝率提高了 10%。而投加了 0. 2 y M 的30C8-HSL溶液后，其多糖浓度提高1. 4倍，絮凝率提高到90. 11%。研宄表明，C6-HSL和 30C8-HSL可以作为自诱导物介导根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciems)F2的群体 感应系统，发挥对多糖合成等菌体生理功能的调控作用。从而达到促进生物絮凝剂合成， 提高生物絮凝剂活性的目的。
[0009] 说明本发明发酵所得的生物絮凝剂可用于进一步实际应用，为其大规模工业发酵 奠定了基础。
【附图说明】
[0010] 图1为外源C6-HSL投加量对多糖浓度和絮凝率的影响图；其中，A为多糖浓度柱 状图；B为絮凝率柱状图；
[0011] 图2为外源30C8-HSL投加量对多糖浓度和絮凝率的影响图；其中，A为多糖浓度 柱状图；B为絮凝率柱状图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0012] 一：本实施方式的一种提高生物絮凝剂活性成分多糖产量的发酵方 法，它是按照以下步骤操作的：首先将生物絮凝剂产生菌接种至絮凝发酵液体培养基中，发 酵制备种子液；然后将种子液接种于投加了外源AHLs的絮凝发酵液体培养基中，进行二次 发酵，即制得生物絮凝剂，完成所述的提高生物絮凝剂活性成分多糖产量的发酵；其中，外 源AHLs为N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯、N-己酰高丝氨酸内酯中的一种或两种按任意比混 合；其中，投加了外源AHLs的絮凝发酵液体培养基为将外源AHLs加入到絮凝发酵液体培养 基中至外源AHLs的终浓度为0. 1 yM~0. 5 yM。
【具体实施方式】 [0013] 二：本实施方式与一不同的是：生物絮凝剂产生菌为 革兰氏阴性细菌。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0014] 三：本实施方式与一不同的是：革兰氏阴性细菌为根 瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciems)F2,保存于中国微生物菌种保藏中心，保藏地址 是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年12月03日，其CGMCC号为10131。 其它与一相同。
[0015] 本实施方式的生物絮凝剂产生菌根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciems)F2 为革兰氏阴性菌，其所产生的生物絮凝剂为该菌的代谢产物，其絮凝活性有效成分主要存 在于发酵液中，絮凝率达到80%以上，并具有良好的热稳定性；通过实验确定了根瘤土壤 杆菌（Agrobacterium tumefaciems)F2的生物絮凝剂中多糖是絮凝功能的主要承担者。而 根瘤菌在合成及运输胞外多糖的过程也受到群体感应系统的调控。而根瘤土壤杆菌能产生 acyl-HSL类信号分子，该信号分子作为自诱导物能引起群体感应对多糖合成的调节。本实 施方式中，投加了外源acyl-HSL类信号分子后，使自诱导物浓度增加到一定阙值后，诱导 多糖合成相关基因表达量增多，导致多糖含量的提高，从而提高生物絮凝剂活性物质的含 量，提高了絮凝活性。
[0016]
【具体实施方式】四：本实施方式与【具体实施方式】一不同的是：外源AHLs为将 N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯分别溶于溶剂二甲基亚砜形成的溶液 或二者混合后的溶液。其它与【具体实施方式】一相同。
[0017]
【具体实施方式】五：本实施方式与【具体实施方式】一不同的是：外源AHLs的 N-3-氧-辛酰高丝氨酸内醋溶液（[N-(3_oxooctanoyl)-L-homoserine lactone， 3-0x0-C8_HSL)和 N_ 己醜高丝氛酸内醋（（N-hexanoyl-L-homoserine lactone，C6_HSL)溶 液的浓度均为0. luM~0.5 yM。其它与【具体实施方式】一相同。
[0018] 本实施方式的N-3-氧-辛酰高丝氨酸内醋溶液（[N-(3_oxooctanoyl)-L-hom oserinelactone，3-0xo_C8-HSL)和N-己醜高丝氛酸内醋（（N-hexanoyl-L-homoserine lactone，C6-HSL)均购买自sigma公司。
【具体实施方式】 [0019] 六：本实施方式与一不同的是：絮凝发酵液体培养基 配制如下：1L蒸馏水中加入10g的葡萄糖、5g的K 2HP04、2g的KH2P04、0. lg的MgS04 ? 7H20、 0. lg的NaCl、0. 5g的尿素和0. 5g的酵母膏；pH为7. 2~7. 5,112°C灭菌30min，即完成絮 凝发酵液体培养基的配制。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0020] 七：本实施方式与一不同的是：生物絮凝剂产生菌接 种前需进行活化培养。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0021] 八：本实施方式与一不同的是：活化培养操作如下： 将生物絮凝剂产生菌转接到普通固体培养基的平皿中活化，于30°C培养1~2天；反复活 化2~3代后，即完成活化培养。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0022] 九：本实施方式与一不同的是：发酵制备种子液的条 件为：发酵温度为30~32°C，转速为140~150r/min，发酵时间为24~26h。其它与具体 实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0023] 十：本实施方式与一不同的是：二次发酵的条件为： 发酵温度为30~32°C，转速为140~150r/min，发酵时间为24~26h。其它与具体实施方 式一相同。
[0024] 本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具