一种酶法合成6-磷酸己糖的方法
【专利说明】
[0001] 本申请涉及序列表。
[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表，通过引用将其并入本文中。
技术领域
[0003] 本发明属于生物化工领域，特别涉及一种酶法生产6-磷酸己糖的方法。
【背景技术】
[0004] 在蛋白质代谢过程中，与细胞核内体、细胞膜和细胞外分泌物有关的蛋白质必须 经过修饰才能转运到细胞中的最终位置。6-磷酸甘露糖（mannose-6-phosphate，M-6_P)就 是广泛存在于生命体中的与蛋白质修饰密切相关的磷酸化糖类化合物。M-6-P与其相应的 受体 6_ 磷酸甘露糖受体（mannose-6-phosphate receptor, M-6-P receptor)结合，在溶酶 体酶发生效应的过程中起着重要的作用，M-6-P是溶酶体酶的分拣员和投送员。
[0005] 溶酶体病是由于基因缺陷而使溶酶体缺乏某种水解酶，使相应的底物无法被降 解，造成细胞代谢障碍。现今，人们已经能够利用酶替代法治疗6种溶酶体缺陷疾病。大多 数的用于治疗溶酶体缺陷疾病的酶都是通过将酶用M-6-P修饰，使其与目标细胞以及器官 上的M-6-P受体结合，从而达到治疗的目的。溶酶体酶的糖链上修饰有M-6-P对于有效地治 疗溶酶体病非常关键。专利号201080035798. 3中提到了甘露糖-6-磷酸及其盐、其前体或 其类似物有减少皮肤发红的用途，同时具有美容效果，并且能够加快受损皮肤的愈合。近年 来，以M-6-P为前体的药物研宄日益受到关注，人们对于M-6-P的需求也随之提升。因此， 寻找一种大规模生产M-6-P的方法是非常有必要的。
[0006] 目前，人们大多数采用化学法来合成M-6-P的类似物，而利用酶法来合成M-6-P 非常的少。化学法基本都是以甲基a-D-吡喃甘露糖苷或者甲基2, 3, 4-三-0-b苯甲 基-a -D-吡喃甘露糖苷为起始物经过3-5步的合成步骤，形成与M-6-P具有相似结 构的类似物。Audrey Jeanjean 等（Synthesis of new sulfonate and phosphonate derivatives for cation-independent mannose 6-phosphate receptor targeting, [J] Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 18 (2008) 6240 - 6243)提到了 一种以甲基 2, 3, 4-三-0-b苯甲基-a -D-吡喃甘露糖苷为起始物，经过氧化以及羟基保护，再对6号位 碳原子上的基团进行脱保护并加上相应的磺酸集团，再对其他碳原子上的基团进行加氢处 理，从而得到相应的6-磷酸甘露糖的类似物。合成过程所需要的条件比较苛刻，需要低温 环境或者需要重金属或有毒试剂的参与，并且总回收率也不高。
[0007] 相比于化学法合成M-6-P的类似物来说，酶法合成M-6-P具有催化效率高、反应条 件温和的优点，且无需有机试剂以及重金属的参与，更加有利于后期的药物合成。酶法合成 M-6-P需要已糖激酶的参与，己糖激酶目前已知有4种不同的型态，这些型态差异是来自相 同基因的选择性剪接，也就是将基因上的外显子（由内含子隔开的部分）重新组合。此外 在不同类型的细胞中，也有许多功能或结构与己糖激酶相似的酶，包括己糖激酶I、己糖激 酶II、己糖激酶III，以及与前三者差异较大的己糖激酶IV(又称为葡萄糖激酶）。这类酶 称为同工酶，它们拥有相同的作用，但是却是由不同的基因所制造。己糖激酶是一种能够以 一种或多种己糖为底物，并能使己糖磷酸化的酶的统称，己糖激酶对底物并没有明显的特 异性。
[0008] 在己糖激酶进行磷酸化过程中所需要的磷酸供体，根据己糖激酶的来源不同而不 同，有的利用三磷酸腺苷（ATP)，有的则可以利用二磷酸腺苷（ADP)。例如：大部分生物中 的己糖激酶在发挥作用时都必须要ATP的参与，ATP-方面作为能源供体，另一方面作为磷 酸供体参与到该反应过程中来，例如人来源的己糖激酶以及酿酒酵母来源的己糖激酶，而 嗜热高温球菌则是利用ADP来进行磷酸化（Shigeyuki Kawai，Takako Mukai，Shigetarou Mori,Bunzo Mikami，Kousaku Murata,Hypothesis:Structures, Evolution, and Ancestor of Glucose Kinases in the Hexokinase Family, Journal of Bioscience and Bioengin eering，2005, 90 (4)，320 - 330.)。已有文献报道利用己糖激酶催化甘露糖合成M-6-P，但该 反应过程需要ATP来提供磷酸基，由于ATP价格昂贵，且不是很稳定，不易于保存。基于以 上因素该过程不利于大规模的生产M-6-P。
[0009] 本发明提供了一种利用无机多聚磷酸型己糖激酶来合成M-6-P的方法，该无机多 聚磷酸型己糖激酶能够利用多聚磷酸盐将甘露糖转化为M-6-P。多聚磷酸盐相比于ATP来 说价格便宜，因此利用该无机多聚磷酸型己糖激酶催化反应来生产M-6-P将大大降低生产 成本，为大规模生产M-6-P提供了一种新途径。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种酶法合成6-磷酸己糖的方法，通过异源表达得到无 机多聚磷酸型己糖激酶来催化合成M-6-P，开辟了一条以多聚磷酸盐和/或ATP盐为磷酸供 体合成M-6-P的酶催化合成途径，为实现M-6-P大规模工业化提供一种新途径。
[0011] 本发明涉及一种酶法合成6-磷酸己糖的方法，其特征在于，所述方法以己糖为底 物，以多聚磷酸盐和/或ATP盐为磷酸供体；将上述反应物置于pH缓冲体系中并向其中 加入无机多聚磷酸型己糖激酶和辅因子，在无机多聚磷酸型己糖激酶的催化作用下合成 6-磷酸己糖。其中，本文上下文中涉及的"无机多聚磷酸型己糖激酶"指的是由分枝杆菌菌 株中表达无机多聚磷酸型己糖激酶的基因重组表达得到的一种己糖激酶。
[0012] 在优选的实施方案中，所述无机多聚磷酸型己糖激酶通过以下步骤制备：
[0013] (1)克隆分枝杆菌（Mycobacterium sp. MCS)中表达无机多聚磷酸型己糖激酶的 基因；该基因的核苷酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表中所示；
[0014] (2)构建所述分枝杆菌中表达无机多聚磷酸型己糖激酶的基因的重组载体；
[0015] (3)将构建好的重组载体转入到宿主细胞中并诱导无机多聚磷酸型己糖激酶基因 表达，得到表达菌体；
[0016] (4)超声破碎所述表达菌体，提取无机多聚磷酸型己糖激酶。所述无机多聚磷酸型 己糖激酶的氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表中所示。
[0017] 在优选的实施方案中，所述无机多聚磷酸型己糖激酶为游离酶或固定化酶。
[0018] 在优选的实施方案中，所述己糖为甘露糖、果糖或葡萄糖。
[0019] 在优选的实施方案中，所述磷酸供体为多聚磷酸盐。
[0020] 在优选的实施方案中，所述多聚磷酸盐为多聚磷酸钠（(NaP03)n)或多聚磷酸钾； 独立地，所述辅因子为二价金属阳离子。其中所有的激酶都需要辅因子的存在，如二价金属 离子，辅因子起稳定供体分子高能键的作用，且为磷酸化的发生提供可能性。
[0021] 在优选的实施方案中，所述多聚磷酸钠为六偏磷酸钠或四聚磷酸钠；独立地，所述 辅因子为Mg 2+或Mn2+。进一步优选地，所述多聚磷酸钠为六偏磷酸钠；所述辅因子为Mg2+。
[0022] 在优选的实施方案中，反应体系中所述己糖的浓度为5-500mmol/L ;独立地，所述 多聚磷酸盐的浓度、或所述多聚磷酸盐和所述ATP盐的浓度之和为5-500mmol/L ;独立地， 所述反应时间为l-25h ;独立地，所述反应温度为10-50°C ;独立地，所述反应体系的pH为 4-10〇
[0023] 在优选的实施方案中，反应体系中所述己糖的物质的量与所述多聚磷酸盐的物 质的量，或所述己糖的物质的量与所述多聚磷酸盐和所述ATP盐的总物质的量的比例为 1:1-1:10。
[0024] 在优选的实施方案中，所述pH缓冲体系为羟甲基氨基甲烷（Tris)-盐酸pH缓冲 体系、柠檬酸-柠檬酸钾pH缓冲体系或甘氨酸-NaOH pH缓冲体系。进一步优选地，所述pH 缓冲体系为Tris-HCl pH缓冲体系。
[0025] 如本文所用，下列术语将具有以下含义：
[0026] "PCR (聚合酶链式反应）"：是指DNA在体外95°C高温时变性会变成单链，低温（经 常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反 应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链的反应。
[0027] "宿主细胞":是指将外源的核酸序列或者载体导入进去的细胞。
[0028] "表达载体":是指能将目的DNA片段带入宿主细胞，并能进行扩增并进行表达的一 类DNA分子，比较常用的是质粒，它是存在于细菌染色体以外的独立的DNA分子。
[0029] "感受态细胞"：是指处于能吸收外源DNA的生理状态的细胞。
[0030] "异源表达":是指将来自其他物种或者生物体的基因在宿主细胞内进行表达。
[0031] "过表达":使克隆的基因在宿主细胞中超过正常水平表达。
[0032] "限制性内切核酸内切酶":是一类能特异性地识别双链DNA序列并进行切割的酶。
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