多噬菌体裂解酶基因的共表达体系、构建方法、携载体系的活疫苗、活疫苗的制备及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因，更具体的说涉及多噬菌体裂解酶基因的共表达体系、携载共表达体系的结核活疫苗技术及其应用。
【背景技术】
[0002]全世界三分之一的人口感染了结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)，其中约90%的活动性结核病由潜伏结核感染(latent tuberculosis infect1n, LTBI)演变而来。LTBI者体内的Mtb处于潜伏状态，机体不能将其彻底清除；在一定条件下，Mtb可重新复制，发展成活动性结核并产生临床症状，成为新的结核传染源。LTBI与结核病的持留感染、久治不愈、再燃复发、肺外播散、多药耐药等现象的形成密切相关。
[0003]目前全球约有20亿人存在Mtb的潜伏感染。我国是结核病疫情高负担国，居世界第二位，国人Mtb感染率约为44.5%。LTBI随时都有可能发展为活动性结核病并成为新的传染源；若同时罹患免疫抑制性疾病，如艾滋病，LTBI发展为活动性结核的机率就更高。
[0004]LTBI已成为结核病防治中的巨大障碍。及早治疗LTBI成为控制结核病传播的最有效手段之一。如果能够及时对LTBI患者进行彻底根治，既可以减少其发展成为活动性结核的机会，又能消除潜在的传染源，对结核病的治疗和控制具有非常重要的意义。
[0005]然而要对潜伏结核感染进行有效的治疗十分困难。现有的异烟肼、利福平、氟喹诺酮类等常规的抗结核药物都是通过抑制活动性结核杆菌的DNA复制或细胞壁合成等方式起作用，对杀灭处于增殖期的菌体效果明显，但对处于胞内潜伏的非增殖状态的细菌作用甚微，甚至没有效果。目前，随着耐多药和广泛耐药结核株病例在我国的快速上升和传播，导致常规抗结核药物对LTBI的治疗效果更是微乎其微。探索新的可以有效治疗和控制潜伏感染性结核的策略迫在眉睫！
[0006]随着致病菌对大多数抗生素产生耐药性问题的出现，人类正在逐渐进入无药可用的“后抗生素”时代。噬菌体对细菌的侵袭具有高度专一性，具有自然裂菌和追踪杀菌的天然性能，且对动植物无明显毒性。噬菌体作为生物制剂以其独特的抗菌优势引起科学家的广泛关注。传染性疾病权威一诺贝尔奖得主Lederberg博士指出:因耐药性细菌的出现，抗生素治疗不再像以前那样有效，应高度重视噬菌体作为抗菌治疗的研宄。目前噬菌体全菌治疗体内细菌感染遇到的最大瓶颈，一是较难实现体内靶向性给药；二是其全菌本身具有较强的免疫原性，体内多次应用会产生中和抗体，使噬菌体失去治疗作用。因此，当前噬菌体全菌疗法大多数集中在皮肤和黏膜表面细菌感染的治疗，而不能有效用于体内细菌感染治疗。噬菌体特异裂解杀死宿主菌的本质是依赖特异的噬菌体裂解酶，比起噬菌体全菌治疗，裂解酶体内应用不易产生中和抗体，噬菌体裂解酶作为一种新的生物治疗手段已受到国内外学者的密切关注。作为新型的抗菌药物，噬菌体裂解酶杀菌具有很多优势:
[0007]A、杀菌具有高效性:细菌的内部高渗透压(约3?5个大气压)由高度交联的细胞壁支撑，任何对细胞壁完整性的破坏都将导致细菌的胞质溢出和最终低渗裂解。噬菌体裂解酶能通过特异水解细菌细胞壁上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连接键，裂解细胞壁，从而能高效彻底地杀死细菌。大量实验证明:裂解酶不仅能在体外高效地杀死细菌，体内应用对感染细菌的模型动物也有很好的治疗作用。纯化的1ng裂解酶作用于链球菌5秒钟后，菌量减少17菌落形成单位。除毒性化学药剂外，尚无任何已知的生物制品能够如此快速灭活细菌，彰显出噬菌体裂解酶强大的杀菌作用。
[0008]B、杀菌具有高特异性:噬菌体裂解酶与抗生素作用机制不同，抗生素通常是广谱的，而噬菌体裂解酶具有极强的特异性，仅攻击杀死特定种类或特定型的病原体，不影响其它无害或有益的人体寄生菌，也不影响人体细胞。不同噬菌体裂解酶的分子量不同(25kD?40kD)，但都由一个决定催化溶菌活性的催化域和一个决定细胞壁结合位点的细胞壁结合域构成。细胞壁结合域可与宿主细胞壁上的特定基质高效、特异结合，这是噬菌体裂解酶实现高效裂解靶细菌的前提。
[0009]C、杀菌不易产生耐受性:研宄发现，应用噬菌体裂解酶分别处理固体培养和液体培养的细菌，处理细菌40多代后亦未能诱导产生耐药现象。当前临床常见的耐药细菌对噬菌体裂解酶不起抗药作用，噬菌体裂解酶在许多菌属多药耐药株治疗上的成功报道表明，噬菌体裂解酶具有广阔的临床应用前景。Mtb具有极为特殊的，富含大量脂质的高疏水性细胞壁。共价交联的分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物是Mtb特有的细胞壁组分。MAPc结构对于Mtb的生存与致病性至关重要，是多种抗结核药物作用的分子靶标。
[0010]Mtb特异性噬菌体D29是从土壤中分离得到的毒性噬菌体，基因组为含49，136bp的双链DNA (GenBank access1n N0.AF022214)。体外、体内研宄证明:D29对Mtb (包括标准株H37Rv和临床上分离的Mtb)有很强的亲噬性与裂解性，其产生的裂解酶具有治疗结核病的重要潜在价值。对普通G+菌而言，仅裂解酶LysinA就能高效裂解肽聚糖破坏细胞壁而杀死细菌。而对于具有特殊细胞壁结构的Mtb而言，噬菌体D29要彻底溶解Mtb细胞壁不仅需要Lys inA裂解肽聚糖，还需要另一种裂解酶LysinB来破坏分枝菌酸与阿拉伯半乳聚糖的连接，才能达到彻底破坏Mtb细胞壁的作用。普通细菌细胞壁破坏后一般就会死亡，但Mtb是一种胞内寄生菌，潜伏感染者体内MΦ (巨噬细胞)中残留的一些细胞壁缺陷型Mtb (cell wall deficient forms, CWD-form or L-form)仍然可能长期存活。Holin 是.菌体编码的另一种裂解因子，靶部位在细菌细胞膜，能特异插入胞质膜形成孔洞杀死细菌。
[0011]作为新一代基因治疗载体的要求是应具有良好的安全性、靶向性和廉价性。耻垢分枝杆菌本身是人体的正常菌群，具有很好的巨噬细胞靶向性。耻垢分枝杆菌递送系统不仅能够把目标质粒很好地靶向导入巨噬细胞中，本身还可作为细胞免疫佐剂，有效地对已经感染Mtb的机体进行二次免疫激发，协同治疗性基因来共同杀灭细胞内潜伏的Mtb。
【发明内容】
[0012]本发明所要解决的第一个技术问题是:针对现有技术存在的不足，提供一种同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。
[0013]本发明所要解决的第二个技术问题是:针对现有技术存在的不足，提供一种同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系的构建方法。
[0014]本发明所要解决的第三个技术问题是:针对现有技术存在的不足，提供一种同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗，对具有特殊细胞壁结构的Mtb、潜伏感染者体内M Φ中残留的一些细胞壁缺陷L型Mtb均具有良好杀灭效果，且对结核感染治疗具有良好的安全性、靶向性和廉价性的优势。
[0015]本发明所要解决的第四个技术问题是:提供携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗在治疗增殖性结核杆菌、休眠性结核杆菌与耐药性结核杆菌引起的活动性结核或潜伏结核感染领域的应用。
[0016]为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案是:
[0017]一种多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，是以真核表达质粒为表达载体，同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。
[0018]作为一种优选的技术方案，所述共表达体系是通过将LysinA、LysinB以及Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的pZMO质粒框架中而获得的。
[0019]作为进一步优选的技术方案，所述共表达体系是通过将获得的LysinA基因片段、LysinB-Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的pZMO质粒框架中而获得的。
[0020]作为一种改进的技术方案，所述共表达体系是通过将获得的LysinA基因片段、LysinB-1ink-Holin融合基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的pZMO质粒框架中而获得的。
[0021]为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案是:
[0022]构建多噬菌体裂解酶基因的共表达体系的方法，包括以下步骤:先用PCR扩增技术分别获得OriM复制子基因