复合型piggyBac重组载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种piggyBac重组载体及其制备方法，还涉及该 重组载体在制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统中的应用。
【背景技术】
[0002] 自1982年第一例利用P因子在黑腹果蝇中介导实现昆虫遗传转化报道以来，基于 转座子的遗传转化系统已经在过去的30多年被广泛用于昆虫和其他无脊椎动物的基础与 应用研宄。其中，应用最为广泛与成熟的转座子系统是来源于粉纹夜蛾（Trichoplusia ni) 的piggyBac转座子。piggyBac是一种典型的II型转座子系统，其内部区域序列编码1个 含594个氨基酸的转座酶。该转座酶可作用于piggyBac转座子两端的末端反向重复序列 (Terminal inverted repeat，TIR)及其临近的DNA序列，进而介导piggyBac转座子从原 位点切除，然后整合至一个新的含有保守的"TTAA"序列的宿主基因组位点。piggyBac转座 子的一个缺点在于，其介导外源基因在宿主染色体的插入位置或插入拷贝数不同，会导致 外源基因的表达受到位置效应的影响，并且可能导致宿主自身所含基因的突变失活，即存 在插入突变现象。而利用位点特异性重组（Site-specific recombination，SSR)技术则能 够有效克服转座子介导的外源基因在基因组随机整合而不具有靶向性和易受整合的位置 效应影响等缺点。
[0003] 位点特异性重组技术是目前实现基因定点插入与定点敲除最有效的手段之一。其 作为一项十分有效的、高靶向性的基因功能研宄和遗传改造的方法体系，已被广泛应用于 拟南芥、小鼠、果蝇等多种模式生物，正逐渐成为转基因动植物研宄领域进行基因操作的强 有力工具。目前最常用的位点特异性重组系统包括FLP/FRT、Cre/loxP和phiC31/att系 统等。链霉菌噬菌体phiC31整合酶作为丝氨酸重组酶家族的成员，可催化细菌附着位点 (attB位点）和菌体附着位点（attP位点）间发生有效的单向性重组。attB位点和attP 位点的最小长度分别为34bp和39bp，attB位点和attP位点重组后产生attL和attR 2个 不同序列的重组位点。在没有辅因子的情况下，phiC31整合酶无法再介导attL和attR位 点间发生重组反应。这种不可逆的重组以及较短重组位点的特点吸引了许多研宄者进一步 研宄phiC31整合酶在高等真核生物遗传工程的潜在应用价值。
[0004] 家蚕是目前世界上人类利用得最成功和最悠久的经济昆虫之一，作为一种相当重 要的鳞翅目模式生物，具有深入研宄的重要价值和意义。随着家蚕基因组框架图、精细图 和遗传突变图谱的完成，家蚕基因组研宄已逐步进入功能基因组时代。基于PiggyBac转 座子系统建立转基因家蚕来开展基因的功能研宄，已经成为目前家蚕功能基因研宄领域最 重要的技术手段之一。家蚕也是目前应用piggyBac转座子最为广泛和相对最为成熟的非 果蝇属昆虫物种。然而，目前利用PiggyBac介导外源基因在家蚕基因组中的随机整合所 带来的位置效应和插入突变现象给家蚕基因功能研宄带来了许多不良影响，例如不可预知 的基因表达的变化、破坏宿主基因的结构、影响转基因家蚕的正常生长发育等。并且，由于 piggyBac介导外源基因整合的随机性，单纯利用piggyBac转座子几乎不可能重复多次介 导不同外源基因在某个确定的靶位点进行定点整合。而如前所述，如果能够利用phiC31/ att位点特异性重组系统介导外源基因在已经确定的家蚕基因组靶位点进行定点整合和替 换，将能够有效克服piggyBac介导外源基因随机插入的缺点。
[0005] 利用转座子系统建立转基因昆虫的另一个潜在问题在于，通过转座载体介导插入 宿主基因组的转基因存在整合后不稳定现象。目前已经在包括黑腹果蝇、赤拟谷盗、地中 海实蝇、斯氏按蚊和家蚕在内的多种昆虫物种中观察到了 piggyBac在宿主基因组中的再 转座现象。宿主基因组中含有具有转录活性的piggyBac-like序列，能编码生成具有活 性的内源性转座酶，是产生这种PiggyBac再转座现象的一个很重要原因。家蚕基因组中 已经鉴定到超过100条piggyBac-like序列，其中许多序列已证实均具有转录活性。利 用piggyBac转座子插入宿主基因组后的再转座，实现piggyBac单侧或两侧包含末端重复 序列的转座子臂序列的删除，是一种消除PiggyBac转座子整合后不稳定现象的有效策略。 2004年，Handler等构建了含有3个转座子臂的复合型piggyBac转座载体，利用piggyBac 的插入后再转座，使得整合进入黑腹果蝇基因组的外源DNA片段仅保留了单侧的1个转座 子臂序列，从而实现了靶基因在黑腹果蝇基因组的稳定整合而不再发生再转座事件。2006 年，Dafa'alia等对piggyBac转座载体进行了进一步改进，他们同样通过利用piggyBac的 插入后再转座，实现了除靶基因以外的所有PiggyBac转座子序列的删除，从而确保了靶基 因在地中海实蝇基因组中的稳定整合。但是，这种通过删除piggyBac两侧臂序列来实现转 基因稳定整合的策略目前尚未应用于家蚕和其他的鳞翅目昆虫物种。
[0006] 因此，结合位点特异性重组系统、优化的piggyBac转座系统以及转基因家蚕外源 蛋白表达系统，探索一种创制稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的通用且有效的方 法，将为有效消除插入位置效应以及潜在的插入突变和整合后不稳定现象对基因表达的影 响，为家蚕的基因功能研宄、不同蛋白表达研宄等提供良好的基础，同时这也是推动家蚕功 能基因组研宄发展的需要和必然。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种复合型piggyBac重组载体，该重组载体可在介 导外源目的基因整合后实现所有转座子序列和筛选标记基因序列从家蚕基因组中完全删 除，仅在家蚕基因组中保留外源目的基因，并可借助phiC31/att系统实现其它外源基因在 家蚕基因组的定点替换；本发明的目的之二在于提供一种所述复合型PiggyBac重组载体 的制备方法，操作简便；本发明的目的之三在于提供所述复合型PiggyBac重组载体在制备 稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统中的应用；本发明的目的之四在于提供一种利用 所述复合型PiggyBac重组载体制备稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的方法，该方 法可以实现除外源目的基因以外的所有转座子序列和筛选标记基因序列在家蚕基因组中 完全删除，确保外源目的基因在家蚕基因组中稳定整合而不发生再转座事件，所得转基因 家蚕表达系统还可以通过基于phiC31/att系统的phiC31整合酶介导的盒式交换（RMCE) 反应实现其它外源基因在相同整合位点的定点替换。
[0008] 具体技术方案如下：
[0009] 1.复合型piggyBac重组载体，在野生型piggyBac转座子臂R1和L1之间插入了 外源目的基因表达框、筛选标记基因表达框I和II、由热激启动子调控的PiggyBac转座酶 (PBase)表达框、以及截短型piggyBac转座子臂L2和R2 ;所述外源目的基因表达框的两端 锚定有2个同向排列的phiC31整合酶识别位点（attP位点），形成attP-外源目的基因表 达框-attP序列；所述截短型piggyBac转座子臂L2正向排列于attP-外源目的基因表达 框-attP序列的5'端；所述截短型piggyBac转座子臂R2反向排列于attP-外源目的基因 表达框-attP序列的3'端；所述筛选标记基因表达框I位于野生型piggyBac转座子臂R1 和截短型piggyBac转座子臂L2之间；所述筛选标记基因表达框II位于截短型piggyBac 转座子臂R2和野生型piggyBac转座子臂L1之间；所述piggyBac转座酶表达框排列于筛 选标记基因表达框II之后，同样位于转座子臂R2和L1之间；所述野生型piggyBac转座子 臂R1的序列如SEQ ID No. 1所示，野生型piggyBac转座子臂L1的序列如SEQ ID No. 2所 示，截短型piggyBac转座子臂L2的序列如SEQ ID No. 3所示，截短型piggyBac转座子臂 R2的序列如SEQ ID No. 4所示，截短型piggyBac转座子臂L2和R2序列的3'端还分别含 有TTAA位点。
[0010] 优选的，所述外源目的基因表达框是以丝腺特异型启动子启动的荧光蛋白表达 框。
[0011] 更优选的，所述外源目的基因表达框是以家蚕丝素重链启动子（FibH)启动的增 强绿色荧光蛋白（EGFP)表达框。
[0012] 优选的，所述筛选标记基因表达框I和II是以组织特异型启动子启动的荧光标记 基因表达框。
[0013] 更优选的，所述筛选标记基因表达框I是以眼和神经特异表达启动子3XP3启动 的红色荧光蛋白（DsRed)表达框；所述筛选标记基因表达框II是以3XP3启动子启动的 EGFP表达框。
[0014] 优选的，所述热激启动子为黑腹果蝇hsp70基因启动子。
[0015] 在本发明的复合型piggyBac重组载体中，除了以FibH启动EGFP基因在家蚕丝腺 中特异表达，并与丝素重链融合表达的FibH-EGFP表达框外，其它外源目的基因表达框同 样适用；除了以3 X P3启动子启动的DsRed表达框和以3 X P3启动子启动的EGFP表达框 外，其它筛选标记基因表达框同样适用；除了 FibH、3 X P3启动子、黑腹果蝇hsp70基因启动 子外，其它丝腺特异型启动子（如丝素轻链基因FibL、P25蛋白基因fhx/P25和丝胶1基因 Seri启动子）、组织特异型启动子（如脂肪体、中肠和血液特异型启动子）、热激启动子也能 够按照本发明提供的策略用于构建复合型PiggyBac重组载体。
[0016] 2.复合型piggyBac重组载体的制备方法，包括以下步骤：
[0017] a.采用上游引物attP-R2-F_SpeI和下游引物R2-R_XhoI，以 pBac {3XP3_DsRedaf}载体为模板进行PCR扩增，得到attP_pBacR2片段，经Spel和Xhol 双酶切后连入口31{3\?346??-5￥40}载体，得到口51{3??-1?2-3\?346??-5￥40}重组载 体；所述上游引物attP-R2-F-SpeI的序列如SEQ ID No. 5所示，下游引物R2-R-XhoI的序 列如SEQ ID No. 6所示；
[0018] b.采用上游引物 SV40-F-NotI 和下游引物 SV40-R-SphI，以pBac{3XP3-DsRedaf} 载体为模板进行PCR扩增，得到SV40polyA片段，经Notl和SphI双酶切后连入pSLfall80fa 载体，得到pSL-SV40polyA重组载体；