坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列及其克隆方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基 因完整的核苷酸序列及其克隆方法。
【背景技术】
[0002] 坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum)是一种严格厌氧的革兰氏阴性多形态 杆菌，主要分布于人和动物的口腔、胃肠道和泌尿生殖道，是一种条件致病菌，常引起人的 急慢性咽喉炎（Lemierre' s syndrome)和牛、羊、鹿等反刍动物的腐蹄病和肝脓肿，多呈慢 性经过，如果治疗不及时，会引起动物蹄部以及肝、肾等内脏器官出现脓肿、坏死等症状，进 而影响动物的生产性能，给养殖业带来巨大经济损失。
[0003] 国内外学者对坏死梭杆菌全基因组及梭菌属其他细菌的研究较少，仍有许多基因 的完整核苷酸序列是未知的，造成对该细菌的致病机理和防控的研究滞后。目前已知细菌 粘附宿主细胞是引起发病的首要步骤，而坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白具有粘附作用， 因此初步推测血凝素相关外膜蛋白在坏死梭杆菌致病过程中起着重要的作用，为了验证这 一推测，就需要通过分离纯化或者基因工程的方法获得血凝素相关外膜蛋白。由于对坏死 梭杆菌血凝素相关外膜蛋白的理化性质方面的研究较少，因此不能通过分离纯化手段得到 天然的血凝素相关外膜蛋白，那么为了深入研究坏死梭杆菌的致病机理，只能先扩增出血 凝素相关外膜蛋白基因，再通过基因工程的方法得到血凝素相关外膜蛋白。
[0004] 国内外的学者对未知基因的克隆方法进行了大量研究，常用的方法有：（1)图位 克隆法：该方法需要先构建覆盖目的基因区域的分子标记连锁图，并以此为基础进一步构 建覆盖目的基因区域的物理图谱，从而克隆两个紧密连锁的分子标记之间的目的基因。该 方法在理论上可以克隆出任何一个基因，但是需要构建高质量的包含目的基因区域的连锁 非常紧密的分子标记图、必须构建基因组文库、CDNA文库等多种文库。由于缺乏坏死梭杆 菌基因组方面的信息，在尚未获得物理图谱、序列图谱、表达图谱和分子标记连锁图的情况 下，利用图位克隆法克隆目的基因显然存在很多困难。（2)同源克隆法：该方法的理论基础 是几乎所有基因之间都彼此相关，功能相近的基因之间既有高度同源区域，也有高度趋异 区，根据功能相近基因的保守氨基酸序列设计简并引物，从而扩增出同源而未知的基因。由 于缺乏坏死梭杆菌基因组及梭菌属其他细菌的生物信息学资料，因此无法确定血凝素相关 外膜蛋白的保守氨基酸序列，也就不能采用同源克隆的方法来扩增血凝素相关外膜蛋白基 因。（3) cDNA末端快速扩增技术即RACE技术，该方法的理论基础是真核生物mRNA的3'末 端的P〇ly(A)尾巴可以作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物 的Oligo (dT) 30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA，然后用一个目的基因特异性 引物GSP1 (gene specific primer，GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引 物UPM(universal primer，UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目 的基因3'末端的DNA片段扩增出来。利用反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到 cDNA第一链的5'末端时自动加上3-5个（dC)残基，退火后（dC)残基与含有SMART寡核苷 酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用 接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引 物，用一个基因特异引物2(GSP 2genespecific primer，GSP)作为下游引物，以SMART第一 链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。该方法主要适 用于真核生物，因为真核生物mRNA的3'末端带有poly (A)尾巴，而原核生物mRNA的3'末 端没有P〇ly(A)尾巴，不能进行反转录合成带有通用引物结合位点的cDNA。
[0005]目前，在GenBank中公布有坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的部分核苷酸序 列，但是对坏死梭杆菌全基因组及梭菌属的其他细菌的研究较少，仍有许多基因包括血凝 素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列是未知的。
【发明内容】
[0006] 为了填补坏死梭杆菌基因组方面的空白，本发明基于GenBank中公布的坏死梭杆 菌血凝素相关外膜蛋白基因的部分核苷酸序列，采用染色体步移方法获得坏死梭杆菌血凝 素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列，填补了坏死梭杆菌基因组方面的空白，同时为克 隆其他未知基因提供一种可行的方法。
[0007] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0008] 本发明的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列如序列表中的 SEQ ID N0:6所示，该完整的核苷酸序列编码的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:7所 /_J、i o
[0009] 进一步的，本发明的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列通过 染色体步移方法克隆得到。
[0010] 本发明还提供一种坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因完整的核苷酸序列的克 隆方法，该方法的条件和步骤如下：
[0011] 步骤一、采用染色体步移方法对坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列进 行克隆和测序
[0012] (1)根据公布号为AF529887. 1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷 酸序列，设计引物：
[0013]SP1:5'-GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'，
[0014]SP2 :5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3'，
[0015]SP3 :5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3'，
[0016]SP4 :5,-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3,，
[0017]SP5 :5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3'，
[0018] SP6 :5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3' ；
[0019] (2)以 FN(AB)的基因组DNA 为模板，Genome Walking kit 中的简并引物 AP1、AP2、 AP3、AP4分别为上游引物，SP1为第一轮PCR的下游引物，SP2为第二轮PCR的下游引物， SP3为第三轮PCR的下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5' 端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50 y L，包括1 y L FN(AB)的基因组DNA， 8 u L 浓度为 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5 u L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer， 0. 5 i! L浓度为5U/ i! L的LA Taq，1 i! L浓度为lOOpmo/ i! L的上游引物，1 i! L浓度为lOpmo/ U L的下游引物,33. L ddH20;第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50ii L,包括1 ii L第 一轮 PCR 扩增产物，8iiL 浓度为 2.5mmol/L each 的 dNTPs ]\^1忉代，51^含]\%、1118的 10XLAPCRBuffer，0. 5 ii L 浓度为 5U/ ii L 的 LATaq，1 ii L 浓度为 lOOpmo/ ii L 的上游引物， 1 U L浓度为lOpmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii L ddH20;第三轮PCR扩增的反应体系总体积为 50iiL，包括 liiL 第二轮 PCR 扩增产物，8iiL 浓度为 2.5mmol/L each 的 dNTPs Mixture， 5 ii L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCR Buffer，0? 5 ii L 浓度为 5U/ ii L 的 LA Taq，1 ii L 浓度为 lOOpmo/ii L的上游引物，1 ii L浓度为lOpmo/ii L的下游引物，33. 5 ii L ddH20 ;PCR反应条 件见【具体实施方式】实施例1中的表3;胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化 E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测 序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基 因5'端未知核苷酸序列如序列表中