坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋 白及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 坏死梭杆菌是一种严格厌氧的革兰氏阴性多形态杆菌，主要分布于人和动物的 口腔、胃肠道和泌尿生殖道，是一种条件致病菌，常引起人的急慢性咽喉炎（Lemierre' S syndrome)和牛、羊、鹿等反刍动物的腐蹄病和肝脓肿，多呈慢性经过，如果治疗不及时，会 引起动物蹄部以及肝、肾等内脏器官出现脓肿、坏死等症状，进而影响动物的生产性能，给 养殖业带来巨大经济损失。
[0003] 获得某个特定蛋白质的方法主要有两种，第一种是通过分离纯化的方法获得天然 的蛋白质，该方法适用于已知各种理化性质（如：分子量、等电点、疏水性、配体特异性等） 的蛋白质，这样可以充分利用该蛋白质的理化性质，从天然材料中分离纯化出特定的蛋白 质，但是对于一些未知蛋白或者理化性质未知的蛋白质来说，该方法显然不是经济有效的。 第二种是通过体外重组的方法，借助于表达载体和表达宿主，获得重组的蛋白质，该方法是 根据编码特定蛋白质的核苷酸序列，设计特异性引物，通过PCR扩增的方法，得到特定蛋白 质的核苷酸序列，将该基因片段连接在表达载体上，转化或者转染表达宿主，在适宜的条件 下进行表达，从而获得重组的特异性蛋白质。
[0004]目前已知细菌粘附宿主细胞是引起发病的首要步骤，而坏死梭杆菌血凝素相关外 膜蛋白具有粘附作用，因此初步推测血凝素相关外膜蛋白在坏死梭杆菌致病过程中起着重 要的作用。目前，在GenBank中公布有坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的部分核苷酸 序列，但是对坏死梭杆菌全基因组及梭菌属的其他细菌的研究较少，仍有许多基因包括血 凝素相关外膜蛋白基因的完整核苷酸序列是未知的，因此也就无法获得纯化度较高的坏死 梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白。目前，迫切需要获得坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基 因完整的核苷酸序列，这样才能对其进行表达获得纯化度较高的坏死梭杆菌重组血凝素相 关外膜蛋白。
【发明内容】
[0005] 为了填补坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的空白，本发明提供一种坏死梭杆 菌重组血凝素相关外膜蛋白及其制备方法。
[0006]本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0007] 本发明提供的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白，该蛋白的基因核苷酸序列如 序列表中的SEQ ID N0:6所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:7所示。
[0008]进一步的，本发明的坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的基因核苷酸序列通过 染色体步移方法克隆得到。
[0009] 本发明还提供一种坏死梭杆菌重组血凝素相关外膜蛋白的制备方法，该方法的条 件和步骤如下：
[0010] 步骤一、采用染色体步移方法对坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列进 行克隆和测序
[0011] (1)根据公布号为AF529887. 1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷 酸序列，设计引物：
[0012]SP1:5'-GCCCCGACTTTGATGTTTCCACTACT-3'，
[0013]SP2 :5'-GCGGGCGGTTCAAATGTTACAGTTCC-3'，
[0014]SP3 :5'-CCGCCGTCGTATTCTTAACTGCCGTTA-3'，
[0015]SP4 :5,-CGCCCCAGACGGATTGGAACAACGAT-3,，
[0016]SP5 :5'-GGCGGGGAAGAATGGGATACCAAGTC-3'，
[0017] SP6 :5'-CGCAACGGATACTGCTGGAGTCATGG-3' ；
[0018] (2)以 FN(AB)的基因组DNA 为模板，Genome Walking kit 中的简并引物 AP1、AP2、 AP3、AP4分别为上游引物，SP1为第一轮PCR的下游引物，SP2为第二轮PCR的下游引物， SP3为第三轮PCR的下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5' 端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50 y L，包括1 y L FN(AB)的基因组DNA， 8 u L 浓度为 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5 u L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer， 〇. 5 ii L浓度为5U/ ii L的LA Taq，1 ii L浓度为lOOpmo/ ii L的上游引物，1 ii L浓度为lOpmo/ U L的下游引物,33. LddH20 ;第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50ii L,包括1 ii L第 一轮 PCR 扩增产物，8iiL 浓度为 2.5mmol/L each 的 dNTPs ]\^1忉代，51^含]\%、1118的 10XLAPCRBuffer，0. 5 ii L 浓度为 5U/ ii L 的 LATaq，1 ii L 浓度为 lOOprno/ ii L 的上游引物， 1 U L浓度为10pmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii LddH20 ;第三轮PCR扩增的反应体系总体积为 50iiL，包括 liiL 第二轮 PCR 扩增产物，8iiL 浓度为 2.5mmol/L each 的 dNTPs Mixture， 5 ii L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCR Buffer，0? 5 ii L 浓度为 5U/ ii L 的 LA Taq，1 ii L 浓度为 lOOprno/ ii L的上游引物，1 ii L浓度为10pmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii LddH20 ;PCR反应条 件见【具体实施方式】实施例1中的表3 ;胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化 E.coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测 序，测序后拼接为1248bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基 因5'端未知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所不；
[0019] (3)以FN(AB)的基因组DNA为模板，SP4为第一轮PCR的上游引物，SP5为第二轮 PCR的上游引物，SP6为第三轮PCR的上游引物，Genome Walking kit中的简并引物API、 AP2、AP3、AP4分别为下游引物，经过三轮PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3' 端未知序列，第一轮PCR扩增的反应体系总体积为50 y L，包括1 y L FN(AB)的基因组DNA， 8 u L 浓度为 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，5 u L 含 Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer， 〇. 5 ii L浓度为5U/ ii L的LA Taq，1 ii L浓度为lOOprno/ ii L的上游引物，1 ii L浓度为10pmo/ U L的下游引物,33. LddH20 ;第二轮PCR扩增的反应体系总体积为50ii L,包括1 ii L第 一轮 PCR 扩增产物，8iiL 浓度为 2.5mmol/L each 的 dNTPs ]\^1忉代，51^含]\%、1118的 10 X LAPCR Buffer，0? 5 ii L 浓度为 5U/ ii L 的 LA Taq，1 ii L 浓度为 lOOprno/ ii L 的上游引物， 1 U L浓度为10pmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii LddH20 ;第三轮PCR扩增的反应体系总体积为 50iiL，包括 liiL 第二轮 PCR 扩增产物，8iiL 浓度为 2.5mmol/L each 的 dNTPs Mixture， 5 ii L含Mg2+plus 的 10 X LAPCRBuffer，0? 5 ii L浓度为 5U/ii L 的 LA Taq，1 ii L浓度为 lOOpmo/ U L的上游引物，1 ii L浓度为lOpmo/ ii L的下游引物，33. 5 ii LddH20 ;PCR反应条件见具体实 施方式实施例1中的表5 ;胶回收目的片段，连接pMD18-T载体，连接产物转化E. coli Trans T1感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对PCR鉴定为阳性的菌液进行测序，测序后拼接 为1023bp的核苷酸序列，该未经验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核 苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；
[0020] 步骤二、坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因未知序列的验证
[0021] (1)根据步骤一的测序结果，设计引物：
[0022] jl :5,-TAGTCGAGTGAGATGAAGCAAGCGGAG-3,，
[0023] J2 :5'-CCCGCCGAGTGAGATGAAACGAGTAC-3' ；
[0024] (2)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列的验证
[0025] 以FN(AB)的基因组DNA为模板，jl为上游引物，SP3为下游引物，采用高保真的 FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的5'端未知序列； PCR反应体系见表4, PCR反应条件：95°C预变性3min，94°C变性30s，61°C退火30s，72°C延 伸50s，30次循环，72°C延伸10min，4°C终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载 体，连接产物转化E. coli Trans T1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后 拼接为1248bp的核苷酸序列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未 知核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0:3所示；
[0026] (3)坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知序列的验证
[0027] 以FN(AB)的基因组DNA为模板，SP6为上游引物，j2为下游引物，采用高保真 的FastPfu DNA聚合酶进行PCR扩增坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因的3'端未知 序列，PCR反应体系总体积为50 ii L,包括2 ii L模板,2 ii L浓度为10μmol/L的上游引物， 2uL 浓度为 lOumol/L 的下游引物，lOuL 5XTransStart FastPfu Buffer, 5iiL 浓度为 2. 5mmol/L each 的 dNTPs Mixture，1 u L 高保真的 FastPfu DNA 聚合酶，28 u L ddH20, PCR 反应条件：95°C预变性3min，94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸50s，30次循环，72°C 延伸10min，4°C终止反应；胶回收目的片段，连接pEASY-Blunt载体，连接产物转化E. coli Trans T1感受态细胞，对PCR鉴定正确的菌液进行测序，测序后拼接为1000bp的核苷酸序 列，该经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列如序列表中 的 SEQ ID N0:4 所示；
[0028] (4)经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知序列与3'端未知 序列的拼接与分析
[0029] 经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列总长度为 1248bp，与公布号为AF529887. 1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷酸序列 重叠174个碱基，经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷酸序列总 长度为l〇〇〇bp，与公布号为AF529887. 1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因部分核苷 酸序列重叠272个碱基，根据重叠的核苷酸序列，将经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外 膜蛋白基因5'端未知核苷酸序列、公布号为AF529887. 1的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋 白基因部分核苷酸序列和经过验证的坏死梭杆菌血凝素相关外膜蛋白基因3'端未知核苷 酸序列拼接在一起，得到总长度为4247bp的核苷酸序列，如序列表中的SEQ ID N0:5所示；
[0030] 利用NCBI在线工具预测4247bp核苷酸序列的开放阅读框，预测结果为4