靶向hsv-1病毒ul18基因的小干扰rna及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物技术领域，特别涉及靶向HSV-1病毒UL18基因的小干扰RNA 分子（siRNA)及应用。
【背景技术】
[0002] 单纯疱疼病毒（Herpessimplexvirus，HSV)属于疱疼病毒科、a疱疼病毒亚科， 是一种以人类为唯一自然宿主的双链包膜DNA病毒，血清学分为HSV-1和HSV-2型。HSV-1 在形成局部的疱瘆病损后，常常以各种方式进一步引起机体神经系统的感染。尤其重要 的是在感染神经系统的过程中，疱瘆病毒能够发挥其生存技巧中最令人叫绝的方式潜 伏-再激活-这个在进化中形成的生物学优势，使得HSV-1能够在很大程度上避开宿主免 疫系统的攻击，从而在机体内长期甚至终生停留。HSV-1感染性疾病常反复发作，迀延难愈， 给病人造成极大痛苦。目前，药物治疗是治疗HSV感染的主要手段。临床常用的治疗药物 主要是无环鸟苷等核苷类及其类似物，如阿昔洛韦（AcyclovihACV)、伐昔洛韦等。其作用 靶点是病毒DNA聚合酶，抑制病毒的复制。肝素可与病毒膜表面糖蛋白结合；化合物SCH 43478及其类似物抑制HSV的立即早期基因的表达；硫脲抑制剂WAY-150138可抑制UL6参 与衣壳组装，抑制子代病毒DNA包装进入衣壳结构。但部分核苷类似物如碘脱氧尿苷、更昔 洛韦等具有诱变性，安全性低，并且在上世纪80年代ACV耐药株即已出现，而且随着抗疱瘆 病毒药物的广泛使用，关于耐药株的报道也越来越多。所以，寻找新的抗疱瘆病毒的治疗方 法和治疗靶点成为科研工作者的研发目标。
[0003] RNA 干扰（RNA interference，RNAi)是双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA) 介导的特异性基因表达沉默现象。在细胞内，dsRNA被核糖核酸酶（又称Dicer)剪切成短 的dsRNA (21~25nt)，这种小的dsRNA被称作siRNA。siRNA中的反义链与多种核酸酶形 成复合体称作RISC复合体。随后RISC复合体被激活成为活性状态（RISC*)。siRNA的正 义链引导RISC*到沉默靶点，RISC*与沉默靶点mRNA结合，在ATP的存在下，mRNA与siRNA 的反义链结合互补，引发核酸酶将mRNA剪切成为21~23nt的小片段，继而阻止mRNA的表 达翻译，导致目的基因的沉默。已有研宄表明siRNA作为高效特异的抗病毒药物具有极大 的发展前景，siRNA在HIV-1，SARS病毒，呼吸道综合症病毒等多种病毒的治疗研宄中被成 功应用。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供靶向HSV-1病毒 UL18基因的小干扰RNA分子（siRNA)及其修饰物。解决了现有HSV-1感染治疗方案中存在 的药物毒性大、易产生耐药性，易复发等缺陷和问题，制得靶向明确，安全可靠，效果明显的 抗HSV-1病毒感染的新型药品。
[0005] 本发明的另一目的在于提供靶向HSV-1病毒UL18基因的SiRNA的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：祀向HSV-1病毒UL18基因的siRNA，所述 的siRNA为siRNA181、siRNA182或siRNA183中的一种或至少两种：
[0007] siRNA181 :正义链：5,-CUCAACGUGCUGUACUACAAC-3' ；
[0008] 反义链：5'-UGUAGUACAGCACGUUGAGGU-3' ；
[0009] siRNA182 :正义链：5,-CCACCAUCAUCCUUACGCUAA-3' ；
[0010] 反义链：5'-AGCGUAAGGAUGAUGGUGGUU-3' ；
[0011] siRNA183 :正义链：5'-CCCGUUAUACGCUAUCCCUAA-3' ；
[0012] 反义链：5'-AGGGAUAGCGUAUAACGGGGG-3' ；
[0013] siRNA N. C :正义链：5' -UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3' ；
[0014] 反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAIT-3' ；
[0015] 其中，siRNA N. C为siRNA阴性对照，其3'端的TT碱基是悬垂序列，是为了增加 siRNA在细胞内的稳定性。
[0016] 本发明中的针对HSV-1病毒UL18基因的siRNA分子，可根据实际需要进行修饰主 要由以下的修饰方式：（1)末端修饰方式（一般在正义链5'端修饰）：焚光基团修饰：FAM， CY3等，修饰目的是便于观察；特殊基团修饰：生物素、氨基、胆固醇、磷酸基、S-S修饰等，其 中胆固醇修饰目的是便于进入细胞，其他修饰目的是利用末端基团进行其他实验。（2)碱基 修饰方式：2'甲氧修饰、2'氟代修饰、硫代修饰等，修饰目的是增加稳定性。
[0017] 所述的siRNA以及衍生的修饰物可用于制备预防或治疗HSV-1及与HSV-1病毒 感染相关的任何疾病的药物或制剂。最主要的用途包括：制成滴眼液，可用于预防和治疗 HSV-1感染引起的眼疾；作为涂抹剂，可用于预防和治疗HSV-1感染引起的口唇疱瘆、生殖 器疱瘆；作为注射针剂，可预防和治疗HSV-1潜伏感染及复发等。
[0018] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0019] (1)本发明克服现有治疗HSV-1感染的药物毒性大、易产生耐药性，易复发等缺 陷和问题，并通过一定的科技手段制得针对UL18基因的抗HSV-1所有小干扰RNA分子 (siRNA)产品及其修饰物。
[0020] (2)本发明提供的治疗或预防HSV-1病毒感染的小干扰RNA分子（SiRNA)，靶向明 确，效果明显；
[0021] (3)本发明所提供的通过siRNA治疗或预防HSV-1病毒感染的新方法是疱瘆病毒 防治的一种新思路。
【附图说明】
[0022] 图1是不同浓度siRNA与lipofectamineRNAiMAX的细胞毒性结果图。
[0023] 图2是实施例4中总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测的结果图。
[0024] 图3是Real time PCR熔解曲线的结果图；其中，图3A为内参引物GAPDH和UL18 基因检测引物的熔解曲线；图3B为内参引物GAPDH和UL18基因检测引物的熔解峰。
[0025] 图4是Real-time PCR检测siRNA干扰对UL18基因mRNA的抑制作用的结果图。
[0026] 图5是流式细胞仪检测UL18-EGFP融合蛋白荧光相对表达强度的结果图。
[0027] 图6是siRNA干扰UL18基因对HSV-1空斑形成的影响的结果图；其中，图6A是不 同实验组形成的空斑；图6B是三种siRNA干扰后各实验组的空斑形成量。
[0028] 图7是siRNA干扰UL18基因对HSV-1感染细胞后胞内病毒粒子数量的影响的结 果图；其中，图7A是HSV-1感染对照组；图7B是阴性对照siN. C对照组；图7C是siRNA182 干扰组。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0030] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制 造厂商所建议的实验条件。
[0031] 实施例1
[0032] 本发明针对HSV-1病毒UL18基因核苷酸序列，设计siRNA双链序列，封闭和抑制 HSV-1UL18基因的表达，导致HSV-1的核衣壳无法正常组装，从而最终抑制HSV-1增殖和感 染，以解决现有HSV-1感染治疗方案中存在的药物毒性大、易产生耐药性，易复发等缺陷和 问题；本发明所提供的siRNA双链序列可用于制备预防或治疗HSV-1及与HSV-1病毒感染 相关的任何疾病的药物或制剂。该siRNA双链序列通过某种方式进入到生物体内时，可以 高效、特异的抑制HSV-1疾病相关衣壳蛋白的表达，使有关基因发生沉默，从而对靶基因的 表达进行有效敲除，达到治疗和预防HSV-1及与HSV-1病毒感染相关的疾病的目的。本发 明靶向明确，效果显著。
[0033] 本发明根据HSV-1UL18基因序列（Genebank登录号：AB618031. 1)，将UL18基因 的编码区序列提交 siRNA 在线设计网站 http://jura. wi. mit. edu/bioc/siRNA ;https:// www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai ；http://www.ambion.com/techlib/misc/ siRNA-f inder. html，根据siRNA设计原则初步设计和筛选潜在的siRNA。将UL18基因序列 提交http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST网站，分析基因序列的保守性，选取不同毒株 及种属间的共同保