表达外源基因的重组流感病毒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种表达外源基因的重组流感病毒及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒是分节段的单股负链RNA病毒，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae)流 感病毒属（Influenza virus)。A型流感是目前最主要的威胁人类及动物健康的疾病之一， 它可以在数月内感染全世界30 %的人口，致死率保守的估计达2 %。但流感的大流行一般 较少发生，平均每10-50年发生一次。二十世纪以来，历史上发生了五次流感大流行，分别 是1918年的西班牙流感、1957年亚洲流感、1968年香港流感和1977年的俄国流感、2009年 的Pademic H1N1流感。每次流感的爆发都给人类的健康和社会经济造成了巨大的损失。为 了预防和控制流感病毒，新的抗流感病毒药物的开发势在必行。
[0003] Tokiko Watanabe等在通过构建一系列缺失质粒，转染后检验比较包装效率后，确 定了对于病毒包装所需要的HA vRNA利用的HA包装信号。表达外源基因的流感病毒可用 于筛选抗病毒药物、中和抗体、用作疫苗、以及用于体内病毒传播和致病性研究。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决目前缺乏高效的抗流感病毒药物的技术问题，提供一种表达外源基 因的重组流感病毒，该重组流感病毒不仅能用于研制新型的病毒疫苗，而且能用于筛选抗 病毒药物。
[0005] 此外，还需要提供一种上述表达外源基因的重组流感病毒的制备方法和应用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0007] 在本发明的一个方面，提供了一种表达外源基因的重组流感病毒，该重组流感病 毒是在PR8流感病毒的HA基因包装信号序列中插入外源基因的重组病毒。
[0008] 优选的，所述外源基因包括：海肾荧光素酶基因、鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域 基因序列、或J19N2亚型SH441毒株HA基因。
[0009] 在本发明的另一方面，提供了一种核酸分子，包含PR8流感病毒的HA基因序列，在 该HA基因的包装信号序列中插入有外源基因序列。
[0010] 所述外源基因包括：海肾荧光素酶基因、鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域基因序 列、或H9N2亚型SH441毒株HA基因。
[0011] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述核酸分子的重组载体。
[0012] 在本发明的另一方面，还提供了一种表达外源基因的重组流感病毒的制备方法， 包括以下步骤：
[0013] 构建含PR8流感病毒HA基因的重组载体，所述HA基因的包装信号序列中插入有 外源基因序列；
[0014] 将所述重组载体，与分别转录PR8病毒PB1、PB2、PA、NP、NA、M、NS基因的质粒、以 及瞬时表达PB1、PB2、PA、NP和HA的质粒一起转染293T细胞，拯救获得表达外源基因的重 组流感病毒。
[0015] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组流感病毒的应用，用于制备抗病毒 疫苗。
[0016] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组流感病毒的应用，用于筛选抗病毒 药物。当本发明重组流感病毒中插入的外源基因是荧光蛋白基因如海肾荧光素酶基因时， 该重组流感病毒可用于筛选新的抗病毒药物。
[0017] 本发明表达外源基因的重组流感病毒，不仅能用于研制新型的病毒疫苗，而且能 用于筛选抗病毒药物。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0019] 图1是本发明实施例2含EDIII肽段重组病毒HA-EDIII-HA表达外源基因的 Western Blot鉴定结果图；
[0020] 图2是本发明实施例2激光共聚焦显微镜观察外源蛋白定位结果图；
[0021] 图3是本发明实施例2病毒传代培养后外源基因检测结果图；
[0022] 图4是本发明实施例2的HA-EDIII-HA病毒在MDCK-HA2细胞上生长曲线图；
[0023] 图5是本发明实施例2的HA-EDIII-HA肌肉注射接种免疫动物实验结果图；
[0024] 图6是本发明实施例2的HA-EDIII-HA静脉注射接种免疫动物实验结果图。
【具体实施方式】
[0025] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京： 科学出版社，2004)中所述的方法进行。
[0026] 本发明利用反向遗传操作技术和稳定表达HA蛋白的细胞系，在PR8-HA包装信号 内插入不同外源基因，构建嵌合重组病毒。并对在MDCK-HA2细胞系中稳定表达外源基因的 重组病毒HA-EDIII-HA，免疫实验动物，跟踪监测动物血液内针对外源蛋白的抗体情况，从 而进一步确定其具有免疫保护效果。
[0027] 本发明首先将PR8的HA基因包装信号插入到RNA转录载体，然后在包装信号之 间分别插入海肾荧光素酶基因（Renilla luciferase)、鸭坦布苏病毒（DTMUV)密码子优化 的或野生的E基因、鸭坦布苏病毒密码子优化或野生的EDIII序列、密码子优化或野生的 H9N2亚型SH441毒株的HA基因，利用流感病毒反向遗传操作系统拯救病毒。结果显示：含 有HA-Renilla-HA、HA-EDIII-HA、HA-441-HA-HA的重组病毒可以拯救成功，通过RT-PCR方 法证明外源基因存在于重组病毒中。
[0028] 本发明进一步将表达外源EDIII肽段的重组HA-EDIII-HA病毒感染MDCK-HA2细 胞进行传代后，用l〇〇y ll〇3TCID5(l感染细胞后，60h后血凝价达到最高为25,48h病毒滴度 最高达到10 5_°TCID5(l/100iil。通过激光共聚焦和Western Blot方法，发现在HA-EDIII-HA 病毒感染细胞中，可同时在胞质检测到NP蛋白和EDIII蛋白的表达。
[0029] 本发明以四周龄的SPF麻鸭为实验动物模型，经肌肉、静脉接种HA-EDIII-HA、 HA-Renilla-HA，同时设阴性对照，免疫两次，用间接ELISA方法跟踪测定麻鸭体内EDIII的 抗体水平。结果显示：HA-EDIII-HA组在二免一周内EDIII抗体快速上升，随后下降，静脉 免疫抗体高于肌肉免疫。第二次免疫后2周，肌肉接种10 3 5ELD5Q的鸭坦布苏病毒FX2010， 攻毒后l、2、3、4d采血，荧光定量PCR检测麻鸭血液中病毒核酸拷贝数，分析病毒在麻鸭体 内的增殖情况。结果显示：攻毒后第一天，HA-Renilla-HA组的病毒核酸拷贝数和对照组相 近，HA-EDIII-HA组较低；第二天，HA-EDIII-HA组病毒核酸拷贝数明显低于HA-Reni 11 a-HA 和PBS组；第三天和第四天，所有组别的鸭子病毒核酸拷贝数含量下降，而HA-EDIII-HA组 明显低于其他组。这些实验结果表明，本发明表达外源基因EDIII的重组流感病毒能在动 物体内激发有效的抗体反应，起到免疫保护作用。
[0030] 实施例1表达海肾荧光素酶（Renilla luciferase)蛋白的流感病毒株
[0031] 1?将Renilla luciferase基因插入含有HA包装信号质粒的构建
[0032]以 pIRES-Renilla 质粒为模板，用 xhoI-Renilla-F 和 NheI-Reni11a-R(xhoI-Reni11a-F ：CTACTCGAGGCCACCATGACTTCGAAAGTTTATGATCC(SEQ ID 引物扩增海肾荧光素酶基因Renilla luciferase序列（SEQ ID NO. 1)。并用XhoI、NheI双 酶切连接于同样双酶切的roC19-HA-packaging signals载体上（本实验室构建，其中，HA 基因的包装信号序列如SEQ ID NO. 21所示，在SEQ ID NO. 21中，43-100位核苷酸序列是插 入的酶切位点），转化，PCR鉴定，提取阳性质粒pUC19-HA-Renilla-HA，用M13-47, RV-M测 序引物测序，
[0033] M13-47 :5, -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3,（SEQ ID N0. 6)，
[0034] RV-M:5,-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3,（SEQ ID NO. 7)。
[0035] 测序正确后，内毒素抽提质粒，于-20°C备用。
[0036] 2?含有 Renilla luciferase 病毒的摇救
[0037] 转染前12_24h，将293T细胞铺于6孔板上，当单层细胞的密度达到80%以上时进 行转染。用转染试剂 Lipofectamine?2000，（除 4 个辅助质粒 pCAGGS-PB2、pCAGGS-PBl、 pCAGGS-PA 和 pCAGGS-NP 每个转染 1 ii g，其余 9 个质粒